第六章 基因功能研究技术(1)

反义RNA作用的关键部位
反义 RNA 并不需要与正义 RNA 全长互补，只 需要与关键部位互补即可起到抑制作用， ① mRNA 5’端非翻译区：包括SD序列或核糖体结 合位点（ribosome binding site，RBS）。SD序列 （Shine-Dalgarno sequence）为细菌mRNA起始密 码子AUG上游7～12个核苷酸处的一个保守区，这 段序列因与16S rRNA 3＇末端反向互补，而被认为 在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。
反义RNA，可收到很好的抗病毒的效果。
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RNAi 的发现
转录后基因沉默（PTGS， post-transcriptional
gene silencing ）最初被认为仅限于矮牵牛花和其它
一些植物中的奇异现象，过去几年中，科研工作者
已明确转录后基因沉默现象普遍存在于动植物中，
在机体防御病毒入侵和转座子沉默效应中起着重要 作用。但是最激动人心的是转录后基因沉默现象的 技术应用，即在多种有机体中应用 RNA 干扰技术进 行特异性的基因剔除以研究相应的基因功能。
发挥作用。在细胞质中与 mRNA 5’ 端互补的反义 RNA 比与 3’ 端互补的有更强的抑制作用，这可能 与反义 RNA 可阻止翻译的起始，却较难阻止肽链 的延伸有关。而在细胞核中，由于反义 RNA 阻止
了mRNA的加工及向核外的运转，所以互补于3’端
的反义RNA也会产生明显的抑制作用。
导入反义RNA的方法
反义RNA对mRNA加工 及翻译过程的调控
反义RNA与靶mRNA形成双链结构，这种双链
分子极不稳定，容易被酶降解，从而使靶mRNA
水平降低。
反义RNA可干扰pre-mRNA的加工成熟，如内
含子的切除。
反义RNA还能抑制mRNA的翻译。
反义RNA在细胞不同 部位的调控作用
反义 RNA 既可在细胞核中，又可在细胞质中
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GST pull-down实验
• GST pull-down实验 基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化 在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱 饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋 白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两 种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。 “诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表 达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方 便。
RNAi 的机理
首先外源导入的dsRNA被切割为19~23nt的小分子
干扰RNA（siRNA）。Dicer作为特异性RNA酶家族的
一个成员，切割dsRNA为19~23nt siRNA，这是一个依 赖ATP的耗能过程. 切割后的 siRNA具有3’两个核苷酸 TT突出末端。然后siRNA结合到RNA酶复合物上形成 RNA 诱导的基因沉默复合体 （ RISC ， RNA-induced
RNAi 的发现
10多年前，Rich Jorgensan和他的同事在矮牵牛
花中发现一种奇怪的现象。他们尝试把由一强力启
动子控制的基因 pigment-producing 导入矮牵牛花，
试图加深花的紫色，结果不但颜色未加深，许多花
呈现杂色甚至白色。Rich Jorgensan把这种现象称为 “共抑制”，因为外源性导入基因和内源性具有相 似功能基因的表达都被抑制了。当时人们不知道这 是一种转录后基因沉默。
反义RNA作用的关键部位
② 起始密码子AUG。
③ mRNA5＇端帽子形成位点。
④ 前mRNA外显子与内含子的结合部。
⑤ mRNA poly A形成位点。
反义RNA对DNA复制的调控
在以 ColE1 为复制子的大肠杆菌质粒中，以复制 起点（ori）上游-555bp处为起点，以一条DNA链为模 板，转录并加工产生RNAⅡ，它们在质粒DNA复制时 作为引物。此外，这种质粒还以复制起点上游 -447bp 处为起点，以另一条DNA链为模板，反向合成一个小 分 子 RNAⅠ 。 RNAⅠ 可 与 RNAⅡ 结 合 ， 并 阻 止 RNAⅡ折叠成三叶草结构，而三叶草结构对于形成稳 定的DNA-RNA杂交体又是必不可少的。Rop蛋白可以 增强RNAⅠ与RNAⅡ的结合，使复制受到抑制。pUC 质粒的 rop 突变使质粒拷贝数增加。这里 RNAⅠ就是 反义RNA。
RNAi 的发现
Fire 和 Mello 发现把反义 RNA 和正义 RNA 的
混合物导入线虫后，其抑制效应远远强于单独导 入 反 义 RNA 或 正 义 RNA 的 抑 制 效 应 。 再 后 来 Baulcomb 和 Hamilton 首先发现约 25nt 的 RNA 能 特异性抑制具有相应互补序列的基因表达。
21～23个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA；
而 对 非 哺 乳 动 物 ， 比 较 有 效 的 是 长 片 段 dsRNA 。
siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间
一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。
RNAi 机理
RNAi 机理
（Dicer）
RNAi 机理
RNAi 机理
第六章 分子生物学研究法（下） ---基因功能研究技术
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提出的问题
海量的基因： 1. 如何表达，如何调控（转录） 2. 什么功能（定点突变） 3. 如何行使功能（蛋白/核酸互作，修饰）
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内 容
1. 2. 3. 4. 5. 6. 基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术
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• 原理： 荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一 种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光 分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围
以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现
象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光 猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。
RNAi 机理
RNAi 机理
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RNAi 的技术路线
RNAi发现的意义
RNAi 的发现具有划时代的意义，它不仅深入 揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因 组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人 类揭示生命奥秘的进程。现在越来越多的研究人员 开始采用RNAi来研究生物体的基因表达。RNAi技 术可广泛应用到包括功能基因组学，药物靶点筛选， 细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。
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GT……AG
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Psa. juncea (A)和 L. racemosus (B)之间的FISH杂交结果，pLrTaiI-1（红色） 和pLrPstI-1（绿色）（Wang et al.，2000）。
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NsNsXmXm基因组（L. duthiei）与Ns基因组（Psa. huashanica）之间的GISH 杂交结果。 A：L. duthiei 基因组DAPI对染；
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荧光共振能量转移技术(FRET)
• 荧光能量共振转移
(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 是较早发展起来的一门技术，随着绿色荧光蛋白
应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物
大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具， 在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免 疫分析等方面有着广泛的应用。
silencing complex ） 。 该 复 合 体 依 赖 ATP 释 能 而 解
siRNA 双链成单链以激活 RISC 。活化的 RISC 通过由 siRNA 决定的碱基互补配对原理切割具有同源序列的
基因转录本，最终导致基因沉默效应。
siRNA
研究发现对哺乳动物细胞，最有效的 siRNAs 是
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PCR介导的定点突变方法，已经成为定点突 变的主流。 变性梯度凝胶电泳，SSCP
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反义RNA及其在基因表达调 控中的作用
在一个基因中， DNA 双链中只有一条链作为模 板转录出功能RNA，相对的另一条链为意义链，以意 义链为模板转录ຫໍສະໝຸດ Baidu的RNA称为反义RNA，它有调控基 因表达的作用。反义RNA通过碱基互补与靶RNA（正 义RNA）形成双链RNA，从而抑制靶RNA的功能。 1981 年首先发现了反义 RNA 在大肠杆菌 ColE1 质 粒DNA复制中的调节作用。1986年又在真核生物小鼠 中发现了反义RNA，以后逐步发现了越来越多的反义 RNA。
RNAi 的发现
双链RNA （ dsRNA ）能导致转录后基因沉默首
先来自于对线虫的研究。 1995 年 Guo 和 Kewphues 试
图用反义RNA来阻断Par-1基因的表达以研究其功能。
确实反义 RNA 抑制了基因表达，出乎意料的是用作
阴性对照的正义 RNA也抑制了基因表达。该结果一 直让人迷惑不解，直至三年后 Fire和 Mello 进行了另 一实验才真正提出 dsRNA 能导致转录后基因沉默的 理论。
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基因芯片技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因
发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病
诊断和预测、药物筛选、基因测序等。另外基因芯片在 农业、食品监督、环境保护、司法鉴定等方面都将作出
反义RNA对转录的调控
大肠杆菌 cAMP 受体蛋白（ CRP ）的合成是 自我调节的。当有过量 cAMP 存在时，激活 crp 基 因位点的互补链转录出反义 RNA 。由于反义 RNA 的 2～6和10～14bp序列与crp mRNA 5＇端的2～ 11bp 序列互补，它们的杂合便形成不依赖 ρ 因子 （参与 RNA 转录终止的一种蛋白因子）的终止子 结构，使crp mRNA的转录过程提前终止（或者说 是无法开始），从而对转录起负调控作用。
达，一方面可使癌细胞停止分裂，另一方面还可以
用于鉴别哪些基因是癌基因。由于导入反义RNA只 能短时间起作用，所以还不能彻底解决问题。
反义RNA技术在抗病 毒感染中的作用
采用与病毒关键 mRNA 互补的反义 RNA，可 阻断病毒 mRNA 的翻译，终止子代病毒的形成。
根据不同情况，给受体细胞导入反义 RNA 基因或
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"
Andrew Z. Fire Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA b.1959 Craig C. Mello University of Massachusetts Medical School Worcester, MA, USA b.1960
导入反义RNA的方法一般有两种，一种是把 反义RNA分子直接导入受体细胞，即先构建与靶 RNA 相应的反义基因，体外转录成反义 RNA ，
然后通过显微注射导入受体细胞中。动物反义
RNA的导入常采用这种方法，这种方法的特点是 作用时间短。另一种方法是用反义基因转化细胞， 使受体细胞自己产生反义RNA，这种方法常用于 植物细胞，可长时间起作用。
B：以Psa. huashanica为探针，用L. elongatum（Ee）进行封阻，L. duthiei14 个染色体表现出红色荧光（Ns）；
C：Ee和Ns同时杂交，14个染色体的全长表现出红色荧光（Ns），同时28 个染色体表现出斑点绿色荧光（Ee）（Zhang et al.，2006）。
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反义RNA的构建原理
反义RNA技术在肿瘤 研究中的应用
肿瘤的发生是由于细胞中基因表达发生了变化，
也就是说，癌变是某些基因表达失控的结果。癌基 因（ oncogene ）可分为两大类：一类是病毒癌基因 （V-onc），另一类是细胞转化基因（C-onc）。 通过导入癌基因的反义 RNA，抑制癌基因的表