手性拆分剂及其手性药物色谱拆分技术的应用进展_梁娴

手性拆分剂及其手性药物色谱拆分技术的应用进展
梁娴，王慧文
(安徽省蚌埠市食品药品检验所，安徽蚌埠233000)
关键词：手性拆分；手性拆分剂；色谱拆分法
近三十年上市的新药中，手性药物占有很大比例，手性药物拆分技术应用广泛，发展也日趋完善。

手性拆分（Chiral Resolution）也称作光学拆分（Optical Resolution），亦或称作外消旋体拆分，为立体化学上，用以分离外消旋化合物成为两个不同的镜像异构物的方法［1］。

例如反应停事件中：药物沙利度胺（反应停）是以对映体的混合物用作缓解妊娠反应药物，造成许多服用过此药的孕妇产下畸婴，经研究发现（R）-沙利度胺具有镇静和缓解妊娠反应作用，而（S）-沙利度胺可酶促水解成邻苯二甲酰谷氨酸并渗透到胎盘，干扰叶酸的合成，产生强致畸作用。

如果能在药物沙利度胺投放市场前就发现R、S构型手性异构体的性质差别并经分离提纯后用药，就可以避免这样的事故。

对手性化合物的识别、拆分或合成。

需要有能够对被研究的手性化合物（客体分子）进行选择性识别或结合的手性化合物（主体分子），这样的主体分子被称为手性选择剂（手性拆分剂），手性拆分剂是具有多重识别位点的手性化合物。

1手性拆分剂（手性选择剂）
根据化学结构不同可以分为：天然多糖及其衍生物（包括环糊精、纤维素、淀粉等多糖衍生物制备的手性固定相）、大环抗生素（主要有利福霉素B、利托菌素A、万古霉素及其衍生物和氨基糖苷类等等）、人工合成的手性大环配体（以N、P、S、Se等杂原子作为给电子原子的聚醚类冠状大环化合物、含氮的大环多胺）、配体交换复合物、手性表面活性剂（包括天然的和合成的两类。

天然的包括胆酸盐、毛地黄皂苷、皂角苷等；人工合成的包括十二烷酰氨基酸钠等）、亲和手性选择剂（包括多肽、蛋白质、糖蛋白和相应的生物聚合物）等［2］。

如黄碧云等［3］以羟乙基-β-环糊精为手性选择剂，确立了苯磺酸氨氯地平对映体的手性拆分方法。

马桂娟等［4］以L-异亮氨酸聚合物手性配体交换固定相对DL-氨基酸进行了有效拆分。

根据作用机制不同还可以分为手性流动相添加剂（Chiral Mobile Phase Additives，CMPA）、手性固定相（Chiral Stationary Phase，CSP）、手性衍生化试剂（Chiral Derivatization Reagents，CDR）三类。

CDR属于间接法使用手性选择剂，以共价键和手性物质结合，在分子内构建手性环境，对手性试剂的纯度要求很高，产物往往不可逆生成；CMPA和CSP属于直接法使用手性选择剂，在分子间构建手性环境，与手性物质基于分子间作用力（氢键、范德华力、π-π或偶极作用）、包结作用构成非对映异构体，所形成的非对映异构体具有可逆性脱去手性选择剂的性质。

CMPA是在流动相中加入手性试剂，利用手性试剂与各对映体结合的稳定常数的不同以及药物与结合物在固定相上分配系数的不同来进行分离的方法。

常用的有：环糊精及其衍生物、冠醚、配位基手性选择剂、手性离子对添加剂、蛋白质、大分子抗生素等［5］。

如贾绍栋等［6］建立了以手性冠醚为手性选择剂，分离吉米沙星对映体的方法。

CSP是先将高纯度的手性试剂化学键合到固定相上，键合后的固定相与药物对映体形成复合物，再根据复合物的稳定常数不同而获得分离的拆分方法，分离的效率和洗脱顺序取决于复合物的相对强度。

根据化学结构类型的不同可以将手性固定相分为：（1）纤维素类固定相；（2）“刷型”手性固定相或称Pirkle型手性固定相；（3）环糊精类手性固定相；（4）蛋白质型手性固定相；（5）大环抗生素型手性固定相；（6）配体交换型手性固定相；（7）冠醚类手性固定相等；也可以根据手性固定相与被拆分的对映异构体间的作用机制进行分类：（1）基于氢键、π-π或偶极吸引等相互作用形成配合物进行
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（收稿日期：2012－05－20，修回日期：2012－10－16）
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拆分的手性固定相，如N-硝基苯甲酰基氨基酸或N-萘基氨基酸酯手性固定相；（2）基于对映异构体进入手性空穴的形成包合配合物的从而进行拆分的手性固定相，如环糊精、冠醚手性固定相和螺旋型聚合物（如三苯甲基丁烯酸酯）等；（3）基于吸引和包合作用形成包合复合物，再进行拆分的手性固定相，如纤维素及其衍生物等；（4）基于疏水和极性相互作用进行手性拆分的蛋白质手性固定相；（5）基于形成非对映异构金属配合物进行拆分的手性固定相，也称为手性配体交换色谱。

手性固定相按其分离机理还可以分为：（1）含有手性空腔的手性固定相（其中包括衍生化纤维素手性固定相、环糊精手性固定相、冠醚手性固定相、合成手性聚合物、手性印迹凝胶相）；（2）手性亲和固定相；（3）手性配体固定相；（4）诱导吸附固定相等。

如张云龙等［7］运用纤维素三苯甲酸酯手性固定相对氧氟沙星、普萘洛尔等五种手性药物进行了薄层分离。

CDR即进行柱前衍生化，是将待分离组分先与高光学纯度衍生化试剂反应形成非对映异构体，再根据非对映异构体的性质差别上非手性柱进行色谱分离的方法。

常用的有酰化试剂、胺类试剂、烷基化试剂、硅烷化试剂、苯甲酰氯为衍生化试剂、羟基衍生化试剂、氨基衍生化试剂等等。

如许颖等［8］以R-（－）/S-（+）-DBD-PyNCS为手性荧光衍生化试剂，采用柱前衍生反相高效液相色谱法建立了分离分析L-乙酰半胱氨酸对映体的方法。

对手性药物进行分离、纯化研究是近20年来药物研究领域的热点之一。

手性拆分法是制备、分离光学活性药物的重要方法。

手性拆分法有结晶法、酶拆分法、化学拆分法及色谱拆分法。

药物分析中色谱拆分法应用较多，下文主要概述色谱拆分法的应用。

2色谱拆分法
色谱拆分法分为直接法和间接法。

直接法是通过手性拆分剂［包括手性流动相添加剂（CMPA）和手性固定相（CSP）］创造手性环境，在分子间引入不对称中心从而进行直接分离，应用范围较广。

间接法是运用高光学纯度的手性衍生化试剂（CDR）与被分析组分反应，将对映体转变为非对映体后，利用其物化性质的不同，在非手性固定相上进行分离，然后经化学转化得到纯对映体。

色谱拆分法根据色谱原理不同还可以分为薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法、高效毛细管电泳法、分子印迹技术。

间接法对手性衍生化试剂纯度要求高、成本高，应用不如直接法广泛。

下文主要简述直接法的应用。

2．1薄层色谱法（TCL）薄层色谱法属于固—液吸附色谱，是利用待分离混合物中各组分的理化性质的差异使各组分在固定相和流动相中的分配系数不同，引起各组分迁移速度的差异而得到分离的方法。

具有经济、操作简便快速的优点，主要用于手性化合物的定性分析。

TCL拆分法主要采用CMPA法和CSP法。

常用的手性添加剂有手性离子对试剂、环糊精及其衍生物等［9］。

如手性固定相有β-环糊精、纤维素及衍生物、分子印迹手性板和浸渍手性试剂的薄层板等等。

Dabrowska等［10］用β-环糊精做为流动相添加剂，HPTLC法手性分离孢呋辛酯非对映异构体，获得良好分离。

Bhushan等［11］把硅胶板分别浸渍L-酒石酸、R-扁桃酸和（－）-红霉素手性溶液中，制备手性固定相薄层板，用正相薄层色谱法直接分离阿替洛尔和普萘洛尔外消旋对映体，结果药物在三种薄层板都实现良好分离。

2．2气相色谱法（GC）气相色谱法是通过选择适当的吸附剂为固定相，使之选择性的吸附外消旋体中的一种异构体从而分离手性化合物的方法。

具有操作简单、分离效率高、灵敏性高的优点，但需要样品能气化，要求被分离体系具有很好的热稳定性。

适用于酸和碱的外消旋体的拆分。

其中毛细管柱GC法应用较广。

拆分手性药物主要采用CSP法和CDR法。

常用的气相色谱手性固定相有三大类：基于氢键作用的氨基酸衍生物手性固定相；基于配位作用的金属络合物手性固定相；基于包含作用的环糊精衍生物、杯环芳烃和冠醚等手性固定相。

还经常将上述3类固定相与聚硅氧烷固定液或毛细管壁进行键合或交联。

应用最多的固定相是各种环糊精衍生物。

任朝兴等［12］研究了以离子液体和碳纳米管作为混合手性固定相的应用。

付滢舟等［13］确立了冰片的手性毛细管柱气相色谱含量测定方法。

2．3超临界流体色谱法（SFC）超临界流体色谱法是以超临界流体为流动相（一种流动相温度、压力均高于或略低于临界点的物质）的色谱技术。

所用流动相有CO2、N2O、NH3、n-C
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［14］。

适用于分离难挥发和热稳定性差的物质。

具有高效、快速、操作条件易于变换等特点，是一种在手性分离方面与高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳法等相互补充，具有一定的发展优势的方法。

SFC主要采用CSP法分离手性药物。

常用的CSP有：环糊精、聚硅氧烷键合相、金属配合物固定相、氨基酸和酰胺类型固定相、多糖类固定相等［15］。

Qian-Cutrone等［16］考察了SFC法对吡嗪酮类八个不同结构对映体化合物的分离作用，他们用Chiralpak AD-H和Chiralcel OD-H柱实现对8对异构体的拆分。

2．4高效液相色谱拆分法（HPLC）高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

具有高效、应用范围广、分离速度快等特点。

几乎所有物质都能通过选择不同的固定相与流动相而进行分离，也是应用最广泛的方法。

高效液相色谱法可采用CMPA法、CSP法和CDR法。

常用的手性流动相添加剂（CMPA）有：环糊精及其衍生物、冠醚类手性添加剂、多糖及其衍生物类、手性离子对添加剂、蛋白质、大分子抗生素等等。

如程燕等［17］以羧甲基-β-环糊精（CM-β-CD）为手性流动相添加剂，用HPLC法分离非尼拉敏、溴苯那敏、扑尔敏等手性药物，达到基线分离。

常用的手性固定相（CSP）有：吸附型手性固定相（又可分为天然高分子类、合成高分子固类、氨基酸类）、配体交换型固定相、蛋白质类固定相、电荷转换型手性固定相（如Pirkle 型手性固定相）、生物碱类和大环抗生素类手性固定相等。

陈星等［18］系统研究了手性配体交换色谱法在手性对映体分析的应用。

沈俊茹等［19］建立了β-环糊精硝基衍生物HPLC 柱分离手性药物扑尔敏的方法。

目前使用广泛的手性柱有Chiralcel OD-H［纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）涂敷型手性固定相］色谱柱、Chiralpak AD-H［直链淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）涂敷型手性固定相］色谱柱、Chiral-
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pak IA［直链淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）键合型手性固定相］色谱柱和Pirkle型的（5，S）-Whelk-01手性固定相色谱柱等。

常用的手性衍生化试剂（CDR）有：苯并唑（苯并呋喃）为母体类、异氰酸酯类、含萘二甲酰胺以及三氟甲基磺酸酯结构类、含其它功能基（氨基、羧基、羟基和酰氯等）类等等。

马力等［20］以邻苯二甲醛为衍生化试剂建立了葛根中精氨酸的色谱测定法。

2．5毛细管电泳（CE）法毛细管电泳法是以高压直流电场作为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为的差异而实现分离。

CE具有能耗低、操作简单、分离模式多、分离效率高等优点。

毛细管电泳法又可分为毛细管区带电泳（CZE）、毛细管凝胶电泳CGE、毛细管胶束电动色谱MEKC、毛细管等速电泳CITP、毛细管电色谱CEC、非水毛细管电泳NACE等方法。

常用的手性选择剂有：环糊精及其衍生物、冠醚及其衍生物、多糖类化合物、大环内酯类抗生素、手性表面活性剂、配体交换复合物和蛋白质等。

如Prpkhorova等［21］用大环肽抗生素eremomycin为手性试剂。

建立了毛细管电泳法对布洛芬对映体的手性分离。

张春雨等［22］用毛细管电泳法建立了2种手性药物（罗格列酮和酮洛芬）对映体的基线分离方法。

2．6分子印迹技术（MIT）分子印迹技术又称分子烙印（Molocular Imprinting），是模拟天然抗原抗体作用原理制备对模板分子具有预定选择性的分子印迹聚合物的技术［14］。

印迹过程可以分为三个步骤：第一步是将功能单体与模板分子结合形成可逆的分子复合物，其中功能单体是经过挑选具有适当功能基的物质。

第二步是通过将过量的交联剂在制孔剂存在下将功能单体相互交联起来形成聚合物，使得功能单体上的功能基在空间排列和空间定向上固定。

第三步是用一定的方法脱去模板分子，使得在高分子聚合物中留下与模板分子在空间结构上完全匹配并含有与模板分子专一结合的功能基的三维空穴，这些空穴对模板分子具有专一性识别作用，可以选择性的重新与模板分子结合，因此可以选择性的与目标化合物结合从而分离目标化合物。

该方法具有操作简单、易于产业化应用等优点。

根据单体与模板分子结合的机理不同分子印记技术可分为分子自组装和分子预组织两种。

分子印记聚合物（MIP）作为高选择性手性固定相包括功能单体、交联剂、引发剂、制孔剂（溶剂）和模板分子。

常用的功能单体有：含乙烯基二醇及含有硼酸酯的硅烷混合物、甲基丙烯酸等。

交联剂有：二甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸丙三醇酯、三丙烯酸季戊四醇酯等。

苯、甲苯和氯仿是常用的生孔剂。

MIP都是通过自由基引发制备的，一般以偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈为引发剂。

在制备手性拆分MIP时一般都采用纯的对应异构体作为模板分子。

邢占芬等［23］以混旋的头孢拉定为模板分子，用高效液相色谱法进行选择性考察，实现了对混旋头孢拉定的拆分。

孙妍等［24］通过对（S）-布洛芬氢键印迹聚合物识别机理的研究有效分离了手性药物（S）-布洛芬。

分子印迹技术在分离、检测中具有较好应用前景。

手性色谱从1939年Henderson、Rule（在乳糖上色谱分离外消旋樟脑衍生物）发现色谱手性拆分法到1952年Dalgliesh （提出氨基酸在纸色谱上光学分离的三点作用假设）奠定色谱拆分理论基础，再发展到现在的几种手性方法协同解析（例如气—质联用及毛细管电泳—安培检测法分离分析手性药物索他洛尔［25］），手性色谱拆分技术已经发展成为手性药物拆分解析最有效的工具。

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