MIDI脂肪酸提取步骤

培养皿的建议划线法(Streaking plates)
利用Sherlock MIS 鉴定微生物时，建议使用Array四区划线法(Quadrant streak pattern) (图2-2)，在该模
式中，第四区有单克隆生长，以确认是否是纯培养，
第三区菌落生长处于对数后期(Late Log)。

图2-2-四区画线式样(Quadrant streak pattern)
从分离培养皿中选择分离良好的单克隆进行
划线。

接种环采用火焰灭菌，接种环可以通过接触
培养皿中无菌落的区域来冷却。

用无菌冷却的接种环挑取菌落，移至另一个新的培养皿中。

划第一区时全部的接种环都与培养基接触，所以此区域为稠密的接种培养；第二区转动接种环90°角，并且用接种环边划过第一区的角落二次，如图表的划法，连续划平行线，不再利用第一区。

接种第三区时，将接种环转动90度角并通过第二区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第二区。

灭菌及冷却你的接种环，接种环可以通过接触培养皿中无菌落的区域来冷却。

接种第四区时，利用转动接种环90度角并通过第三区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第三区。

这种划线方式提供了充足的材料以供分析，同时能确认所得的细菌是纯培养物。

培养条件(Incubation)
大多数稳定的脂肪酸成份是从培养的对数后期（late log）中生成的。

Sherlock数据库构建时也多数选择在此培养条件下微生物。

下述的标准培养条件状况也符合多数实验室的习惯。

所使用例外的注意事项在实验室的列表在Appendix B。

选用小容积高质量的培养箱，使得生长条件可以得到良好的控制。

培养箱过大或者大量样品共用培养箱可能难以维持良好的生长条件。

不要在培养箱中残留任何消毒药剂，因为这些药剂即使在空气中只有低浓度残留，也可能影响微生物的生长。

好氧菌培养条件(Aerobic Incubation)
标准的好氧菌(TSBA 50)培养性况如下:
z培养温度28 ±1℃
z培养时间24 ±2小时
临床的好氧菌(CLIN 40)则要求的培养温度为35±1℃。

生长速度慢的微生物(Slow-Growing Organisms)
微生物生长的对数前期，其脂肪酸成分虽然在性质上稳定，但其总量可能尚未达到稳定的重现性。

因此24小时的培养时间对于分析生长速度较慢的微生物可能会得到结果相似值(Similarity index)较低甚至误判，对于这类微生物，需要延长培养时间以获得较好的重现性。

分析及鉴定那些在正常培养时间内没有生长充分的菌落（第三区培养物产物不足的情况）:
z从第1，2区获菌，上机分析作为第一轮鉴定结果。

z继续培养该平板，直至菌落生长状态良好。

z培养结束后，在第3区获取菌，分析，确认第一轮的结果。

生长环境苛刻的微生物(Fastidious Organisms)
并非所有的微生物都可以在标准条件下培养，有些苛刻的微生物也许要求加富的培养基或特殊的空气条件。

对于这类微生物，其适合的培养条件列入文库列表之后。

(可参考第五章－查看已安装的数据库)。

用Sherlock鉴定的微生物应在指定培养条件下培养。

构建数据库时，亲缘关系较近的苛刻微生物在同样的条件下培养，培养条件一般同这些微生物从自然界中分离时所必需的分离条件类似。

萃取记录单(Extraction Log Sheet)
培养皿在培养后的24小时，建议你能填一张萃取记录单(Extraction Log Sheet: 表2-3) 这张单子记录下你的萃取样品编号并保证它于自动进样器的位置是对应的。

你可以根据自己实验室的需要和喜好改变这张表格的格式。

萃取记录
单上的“Sample ID＂必须同培养皿上的标示保持一
致。

而且这个标示同电脑程序中样品列表中的栏目
内容保持一致（详细的讨论参见下文）。

同时注意，
这是可能尚不知道在气相色谱仪的样品盘的位置，
所以这一栏可以暂时空着。

图2-3-萃取记录单(Extraction Log Sheet)
标示培养管(Labeling Culture Tubes):
每个培养盘的信息都填到萃取记录单
（Extraction Log Sheet）中之后，在获菌步骤之前，
操作人员必须去标示每支培养管（这些管用于下面的萃取步骤，译者按），标示管子的编号必须和萃取记录单中的记录相同。

注意事项: 使用实验室专用笔直接书写在玻璃管上，避免使用标签纸，因为它们在沸腾的水浴中容易脱落。

样品制备: 5个基本步骤(Preparing Extracts: Five Basic steps):
在萃取过程中，每个样品放在一个单独的试管中，一次可以方便地处理多至50个样品。

萃取过程中的每个步骤都摘要显示在图2-4。

1 获菌(Harvesting)
四区划线法能使接种对象得到良好地分散，这样第四区能够包含分离良好地克隆，方便操作者检验平皿中是否为纯培养物。

收获细菌的区域必须是表现为汇合生长的但密度最低的部位（这些菌大多处于对数生长后期）。

这个区域的菌其脂肪酸组分最为稳定，因为接种物密度适当，所有的克隆都营养充足，生长良好。

区。

对于生长较慢的微生物，可能
需要在划线时增加接种环通过前一
区的次数，从二次增加为四至六次。

或者可取用第二区的菌落。

如果从培
养皿中不正确的区域取出微生物可能会引起数据库匹配相似度差。

从第三区取出
的微生物是最佳的；然而，如果生长较慢的微生物也可从第1及2区取出。

用无菌的4mm接种环轻括培养基的表面，收集培养物。

来回刮取并伴随接种环角度的转动有利于收集菌落。

一环湿的培养物（大约40毫克）足够用于后续实验。

有些培养物不易粘附于金属的接种环上。

此时可以用塑料接种环，或者用巴斯德吸管弯成的小环，或者小一点直径的金属圈来代替。

注Array意要收集到合适量的培养物。

可以通
过结果报告中的总峰面积或者称重
来判断以积累经验。

注意事项: 在做下一个步骤前，须确
认盖子必须与试管完全吻合（以免泄
漏）。

z将收集的培养物转入一个干净，
干燥13mmx100mm有螺旋盖的培养试管。

注意将样品抹拭在试管的底部。

z请确认培养管标示了与培养皿上一致的号码(同Extraction Log Sheet中的记录保持一致)，利用实验专用的笔直接写在玻璃上。

试管可以清洁后重复使用。

将所有的培养皿收集完后可进入下一步。

2 皂化(Saponification)
甲醇和碱联用的强烈环境，再加上加热，可以杀灭细菌并使细胞裂解，使脂肪酸从细胞膜中解离出来，变成钠盐。

注意事项: 利用沸水浴或循环水浴。

不要使用加热板或其它加热的方式，因为它们传热不充分。

图
-7-皂化步骤
z向每个样品管中加入1.0±0.1ml的试剂1（甲醇碱）。

z用干净Telfon-lined螺旋盖子旋紧每个试管。

z剧烈震荡试管5-10秒。

z此批的所有样品试管在试管架上放入沸水或循环水95-100℃的水浴中。

注意事项: 加热已锁紧的试管会产生压力可能使玻璃器皿破裂。

建议加热时利用化学安全盖或利用塑料罩，全程穿戴安全护目镜。

z五分钟之后，从沸腾的水中取出试管并稍微冷却，不要打开盖子，震荡每支试管5-10秒再放回水浴中。

z确认试管是否漏气，可以观察此刻是否有气泡在试管中升起作为证据,再拧紧漏气的试管盖子，如果继续产生气泡，样品必须冷却到室温下，然后转移到新的试管。

z继续在水浴中加热这些试管25分钟。

z在水浴中总共皂化约30分钟以后，取出试管，打开水龙头，用水冲洗试管外壁以冷却。

不建议使用冰水浴。

3 甲基化(Methylation)
甲基化脂肪酸形成脂肪酸甲酯(fatty acid methyl esters),以增加脂肪酸的挥发性以利于GC分析。

图2-8-甲基化步骤
z开盖加入试剂2，2.0±0.1ml甲基化试剂，注入每个试管。

z拧紧盖子震荡液体5-10秒。

因为这一步试剂是过量的，可能会形成一些小的颗粒状沉淀，所以必须及时进入下一步。

z水浴加热试管80℃, 10分钟。

z取出试管，快速冷却至室温。

可以利用一盆水龙头流出的冷水（不建议使用冰水），摇晃试管加速冷却的过程。

注意事项: 水浴时间和温度如果超过要求，可能会降解环丙烷复合物，从而改变脂肪酸图谱和峰的命名。

4 萃取(Extraction)
通过液液萃取的步骤，将脂肪酸甲酯从酸性亲水相转移到有机相。

注意事项: Hexanel/MTBE是可燃的，使用时要熄灭所有可燃物和热源。

图2-9-萃取步骤
z在每个试管中加入1.25±0.1ml 的试剂3-
萃取溶剂。

z盖紧盖子，将试管放在一个实验室的旋转器温和混合旋转10分钟。

z打开管盖，利用干净的巴斯德吸管移出每个试管中的下层水相丢弃。

5. 碱洗涤(Base Wash)
向样品中加入一定量的稀碱液，以除去有机萃取相中的游离的脂肪酸和残余的试剂。

残余试剂将会影响色谱分析，引起拖尾和羟基脂肪酸甲酯峰的丢失。

图2-10-碱洗涤步骤
z加入3.0±0.21ml试剂4，稀碱液至每个试管。

z拧紧盖子和温和利用旋转混匀仪混匀试管5分钟。

z如果液面混浊，建议将试管进行短时间的离心（2000rpm三分钟）,使分层更加清晰。

注意事项: 在使用试剂离心前，先用水检验试管牢固程度。

也可以:
向试管中加几滴饱和氯化钠溶液，能减少乳化现象。

用手握着试管在两个手掌间快速转动（保持管身垂直），然后静止几分钟）。

萃取物移至样品小瓶(Transfer of Extract to Sample Vial)
z在样品小瓶上做好标记，操作人员必须使用来自于萃取记录单(Extraction Log Sheet)上的响应信息，以免搞混。

注意事项: 螺旋盖子的样品小瓶也从实验室耗材供应商那里购买。

请使用实验室专用笔去标示样品小瓶，不要用不干胶之类的标记。

因为那样可能影响自动进样器的工作。

z打开每个试管的盖子，利用洁净的巴斯德吸管伸入试管，移出上层有机相的2/3，移到干净的GC样品小瓶。

两层液体的界面有时会不太明显，必须小心操作，不可取出任何水相（下层）的部份。

z给样品小瓶固定好盖子。

z手持小瓶试着转动盖子以确认盖子已经盖紧，应该很难转动，如果太松，调整盖子加盖器(Stop screw in the handle)和重新给样品小瓶加盖。

当所有的样品萃取液移至样品小瓶中后，操作人员可以开始设定自动进样器，并开始执行样品检测，下一章将会讨论相关内容。

样品处理中可以暂停的地方(Delay During Sample Preparation)
理想状态下，细菌收获后，样品处理过程应该连续进行。

如果必须中间停顿，下列步骤中可以进行短时间的中断而不会对分析造成大的影响。

z获菌后，在加入试剂1之前，样品可被保存在试管中1～2个小时或快速冷冻。

如果有大量的样品要被处理，可将培养皿从培养箱中分批取出，进行获菌操作。

把获菌后的底部带有菌样的试管放回到培养箱中或者进行冷冻，然后再处理下一批。

当所有的培养皿都处理完后，从储存处取出所有试管，再集中进行皂化步骤。

z在经过甲基化步骤后，不能停顿，要尽快进入下一步。

z在萃取后，去除水相，有机相可以在冷藏室中过夜。

z样品在稀碱中可能降解，所以在碱洗涤后要迅速移出上层液。

z萃取完成后，样品放入GC小瓶，可以在冰箱中冷藏数天再进行GC分析。

z GC分析后，萃取物可以在冷藏室中保存数日，要更换样品瓶的隔垫(septum)以防止液体的挥发。

提取步骤（简要）
提取方法：自配溶液有，溶液I，45 g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水；溶液II，97.5ml浓盐酸，137.5ml甲醇溶于65ml
蒸馏水；溶液III，200ml正己烷与200ml甲基叔丁基醚混合均匀；溶液IV，10.8克氢氧化钠溶于900ml蒸馏水；溶液V，饱和氯化钠溶液。

1. 取40mg细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液I，
拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5-10秒，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min；
2. 待样品管冷却后，加入2ml溶液II，盖严振荡，随后精确控制
80±1℃水浴10min，冷水浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏；
3. 在冷却的样品管中加入1.25ml溶液III，快速振荡10min左右，
弃去下层水相；
4. 在剩余有机相中加入3ml溶液IV及几滴溶液V，快速振荡5min
左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。