MIDI脂肪酸提取步骤

培养皿的建议划线法(Streaking plates)

利用Sherlock MIS 鉴定微生物时，建议使用Array四区划线法(Quadrant streak pattern) (图2-2)，在该模

式中，第四区有单克隆生长，以确认是否是纯培养，

第三区菌落生长处于对数后期(Late Log)。

图2-2-四区画线式样(Quadrant streak pattern)

从分离培养皿中选择分离良好的单克隆进行

划线。接种环采用火焰灭菌，接种环可以通过接触

培养皿中无菌落的区域来冷却。

用无菌冷却的接种环挑取菌落，移至另一个新的培养皿中。划第一区时全部的接种环都与培养基接触，所以此区域为稠密的接种培养；第二区转动接种环90°角，并且用接种环边划过第一区的角落二次，如图表的划法，连续划平行线，不再利用第一区。

接种第三区时，将接种环转动90度角并通过第二区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第二区。

灭菌及冷却你的接种环，接种环可以通过接触培养皿中无菌落的区域来冷却。

接种第四区时，利用转动接种环90度角并通过第三区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第三区。这种划线方式提供了充足的材料以供分析，同时能确认所得的细菌是纯培养物。

培养条件(Incubation)

大多数稳定的脂肪酸成份是从培养的对数后期（late log）中生成的。Sherlock数据库构建时也多数选择在此培养条件下微生物。下述的标准培养条件状况也符合多数实验室的习惯。所使用例外的注意事项在实验室的列表在Appendix B。

选用小容积高质量的培养箱，使得生长条件可以得到良好的控制。培养箱过大或者大量样品共用培养箱可能难以维持良好的生长条件。不要在培养箱中残留任何消毒药剂，因为这些药剂即使在空气中只有低浓度残留，也可能影响微生物的生长。

好氧菌培养条件(Aerobic Incubation)

标准的好氧菌(TSBA 50)培养性况如下:

z培养温度28 ±1℃

z培养时间24 ±2小时

临床的好氧菌(CLIN 40)则要求的培养温度为35±1℃。

生长速度慢的微生物(Slow-Growing Organisms)

微生物生长的对数前期，其脂肪酸成分虽然在性质上稳定，但其总量可能尚未达到稳定的重现性。因此24小时的培养时间对于分析生长速度较慢的微生物可能会得到结果相似值(Similarity index)较低甚至误判，对于这类微生物，需要延长培养时间以获得较好的重现性。

分析及鉴定那些在正常培养时间内没有生长充分的菌落（第三区培养物产物不足的情况）:

z从第1，2区获菌，上机分析作为第一轮鉴定结果。

z继续培养该平板，直至菌落生长状态良好。

z培养结束后，在第3区获取菌，分析，确认第一轮的结果。

生长环境苛刻的微生物(Fastidious Organisms)

并非所有的微生物都可以在标准条件下培养，有些苛刻的微生物也许要求加富的培养基或特殊的空气条件。

对于这类微生物，其适合的培养条件列入文库列表之后。(可参考第五章－查看已安装的数据库)。

用Sherlock鉴定的微生物应在指定培养条件下培养。

构建数据库时，亲缘关系较近的苛刻微生物在同样的条件下培养，培养条件一般同这些微生物从自然界中分离时所必需的分离条件类似。

萃取记录单(Extraction Log Sheet)

培养皿在培养后的24小时，建议你能填一张萃取记录单(Extraction Log Sheet: 表2-3) 这张单子记录下你的萃取样品编号并保证它于自动进样器的位置是对应的。你可以根据自己实验室的需要和喜好改变这张表格的格式。萃取记录

单上的“Sample ID＂必须同培养皿上的标示保持一

致。而且这个标示同电脑程序中样品列表中的栏目

内容保持一致（详细的讨论参见下文）。同时注意，

这是可能尚不知道在气相色谱仪的样品盘的位置，

所以这一栏可以暂时空着。

图2-3-萃取记录单(Extraction Log Sheet)

标示培养管(Labeling Culture Tubes):

每个培养盘的信息都填到萃取记录单

（Extraction Log Sheet）中之后，在获菌步骤之前，

操作人员必须去标示每支培养管（这些管用于下面的萃取步骤，译者按），标示管子的编号必须和萃取记录单中的记录相同。

注意事项: 使用实验室专用笔直接书写在玻璃管上，避免使用标签纸，因为它们在沸腾的水浴中容易脱落。

样品制备: 5个基本步骤(Preparing Extracts: Five Basic steps):

在萃取过程中，每个样品放在一个单独的试管中，一次可以方便地处理多至50个样品。萃取过程中的每个步骤都摘要显示在图2-4。

1 获菌(Harvesting)

四区划线法能使接种对象得到良好地分散，这样第四区能够包含分离良好地克隆，方便操作者检验平皿中是否为纯培养物。收获细菌的区域必须是表现为汇合生长的但密度最低的部位（这些菌大多处于对数生长后期）。这个区域的菌其脂肪酸组分最为稳定，因为接种物密度适当，所有的克隆都营养充足，生长良好。

区。

对于生长较慢的微生物，可能

需要在划线时增加接种环通过前一

区的次数，从二次增加为四至六次。

或者可取用第二区的菌落。如果从培

养皿中不正确的区域取出微生物可能会引起数据库匹配相似度差。从第三区取出

的微生物是最佳的；然而，如果生长较慢的微生物也可从第1及2区取出。

用无菌的4mm接种环轻括培养基的表面，收集培养物。来回刮取并伴随接种环角度的转动有利于收集菌落。

一环湿的培养物（大约40毫克）足够用于后续实验。有些培养物不易粘附于金属的接种环上。此时可以用塑料接种环，或者用巴斯德吸管弯成的小环，或者小一点直径的金属圈来代替。注Array意要收集到合适量的培养物。可以通

过结果报告中的总峰面积或者称重

来判断以积累经验。

注意事项: 在做下一个步骤前，须确

认盖子必须与试管完全吻合（以免泄

漏）。

z将收集的培养物转入一个干净，

干燥13mmx100mm有螺旋盖的培养试管。注意将样品抹拭在试管的底部。

z请确认培养管标示了与培养皿上一致的号码(同Extraction Log Sheet中的记录保持一致)，利用实验专用的笔直接写在玻璃上。试管可以清洁后重复使用。