以氧消耗速率指导的补料培养基优化提升糖化酶发酵水平

以氧消耗速率指导的补料培养基优化提升糖化酶发酵水平张士杨;王泽建;王兴吉;郭美锦;储炬;庄英萍;张嗣良

【摘要】黑曲霉产糖化酶发酵过程数据显示,发酵中后期产酶速率的下降与采集的生理代谢参数氧消耗速率(oxygen uptake rate,OUR)的降低有着重要相关性,OUR 的降低与某些营养元素控制的菌体生长和代谢有关.该文利用Design Expert软件,通过单因素筛选实验、Plackett-Burman设计和中心组合设计对黑曲霉产糖化酶发酵过程中的补料培养基进行优化,确定了流加培养基:棉籽蛋白4.19 g/L,糖蜜9.01 g/L,硫酸铜0.015 g/L,由此明显改变了后期OUR快速下降和产物合成速率降低的问题.50 L反应器中的发酵验证实验表明,添加了优化的补料培养基的糖化酶酶活比未添加的罐批提升了11.35％以上,可明显提升糖化酶生产效率.

【期刊名称】《食品与发酵工业》

【年(卷),期】2016(042)004

【总页数】7页(P17-23)

【关键词】氧消耗速率(OUR);黑曲霉;糖化酶;补料培养基;优化;Plackett-Burman 设计;中心组合设计

【作者】张士杨;王泽建;王兴吉;郭美锦;储炬;庄英萍;张嗣良

【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;山东隆大生物工程有限公司,山东临沂,276410;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应

器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237

【正文语种】中文

糖化酶(葡萄糖淀粉酶)，又称为γ-淀粉酶或淀粉葡萄糖苷酶，是食品工业中一种需求量很高的商业生物催化剂，近年来已经变成工业酶的第二大市场[1]。随着我国

淀粉糖业的快速发展，糖化酶的需求量日益增加，同时随着能源和生产原材料价格的增加，市场竞争力和利润空间越来越小，提高糖化酶的生产能力，降低生产成本，是提升该产业市场竞争力的关键。

众多研究报道显示，初始培养基的优化[2-5]、不同发酵容器的优化、分批培养连

续培养的应用[6-8]，以及培养条件如含水率、温度、pH、溶氧、搅拌的优化[9-10]等均可以较好地提高糖化酶的生产水平。但在工业生产过程中仍然面临发酵中

后期酶增加缓慢，转化率低的普遍现象，在线生理代谢参数及相关性分析的缺乏已成为进一步优化生产控制工艺，提升发酵水平的关键。本文结合糖化酶发酵过程生理代谢参数的采集系统，利用多参数相关分析找到了氧消耗速率

(oxygen uptake rate，OUR)控制与产物合成的相关性，并通过单因素筛选实验、Plackett-Burman设计和中心组合设计考察了补料培养基与生理代谢参数的变化，证明了结合统计学方法和生理代谢参数OUR进行补料培养基的优化，进而提高糖化酶在反应器水平上的产量的可行性，为进行下一步相关优化实验提供了理论基础。

1.1 材料

1.1.1 菌株

产葡萄糖淀粉酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger LDM3，由山东隆大生物工程有

限公司提供。

1.1.2 培养基

种子培养基(g/L)：玉米淀粉80，玉米浆12，豆饼粉8。

发酵培养基(g/L)：玉米淀粉200，玉米粉50，豆饼粉12，玉米浆18，

KH2PO4 10，(HN4)2SO4 2，CaCl2 0.3。

补料培养基(g/L)：1水葡萄糖500，CaCl2 0.375。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养

将茄子瓶于34 ℃的恒温培养箱中培养5 d后刮下菌苔接种于装液量为400 mL的2 L摇瓶中，然后放置于34 ℃的摇床间260 r/min培养72 h。之后接种于15 L 种子罐中，通过调节转速和通气使溶氧不低于30%，待残糖质量浓度降至

50 mg/mL时移种于50 L罐。

1.2.2 50 L罐培养

本研究采用50 L搅拌式生物反应器(上海国强生化装备有限公司)，初始装液量为25 L，接种量为5 L，33 ℃，发酵过程中通过流加氨水控制pH为4.5～4.6。前期通过调节通气和搅拌控制溶氧不低于40%，直至达到最大转速(550 r/min)和最大通气量(5 500 L/min)都无法改变的氧限制阶段。分别通过溶氧电极和pH电极(梅特勒-托利多，瑞士)在线监测溶氧(DO)和pH。当发酵液中残糖浓度降至

50 mg/mL时开始补料，并且在之后的发酵过程中控制DE值在35～45 mg/L。当菌体分化结束后(即溶氧回升阶段之后)将一部分发酵液转移至摇瓶中继续培养。

1.2.3 摇瓶培养

本研究采用500 mL摇瓶，装液量为40 mL，在接受50 L罐转移的发酵液之后放置于34 ℃的摇床间190 r/min进行培养。

1.3 分析方法

菌体浓度(以PMV表示)的测定：取发酵液10 mL于离心管中，4 000 r/min离心10 min后,沉淀物占10 mL发酵液的体积百分比即为菌体浓度。

残糖浓度的测定：按照萨氏法进行测定[11]。

NH2-N浓度测定：按照甲醛氧化法进行测定[12]。

糖化酶酶活的测定：酶活使用淀粉葡萄糖苷酶(AGI)表示。1个AGI单位定义为：

在pH 4.3和温度60 ℃条件下每分钟从可溶性淀粉水解生成1 μmol葡萄糖所需

的酶量。50 mg糖化酶标品对应大约2 500 AGI。糖化酶酶活量测量：230 μL p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(AGIsub)试剂(37 ℃预热5 min)与20 μL发酵上清

液混合，37 ℃反应20 min后加100 μL AGIsub试剂，在405 nm下测量混合液体吸光度来定量糖化酶。

尾气测定：发酵过程中的摄氧率(OUR)由过程尾气质谱仪(MAX300-LG，Extrel，USA)测得的氧气含量经软件Biostar计算得到[13]。

1.4 实验设计

黑曲霉产糖化酶发酵过程OUR、溶氧及酶活变化曲线如图1。由图1可明显看出，71 h左右溶氧开始回升，OUR亦快速增加，此时菌体开始分化。当OUR达到峰值，溶氧重新回到氧限制阶段后菌体分化结束。结合酶活变化曲线可知，在菌体分化阶段，产酶速率稍有减慢(75～91 h)，分化结束后OUR开始下降，产酶速率随之降低，110～130 h期间OUR下降幅度较91～110 h有所减小，产酶速率较前一阶段亦有所增加，130 h后OUR再次急剧下降，产酶速率再次变慢，由此得知中后期产酶速率的下降与OUR有着密切联系。而OUR的降低与某些营养元素控

制的菌体生长和代谢有关，后期补料又仅有糖和氯化钙两种，所以本文希望通过优化补料培养基来改变中后期OUR下降的不利状况，进而提高产酶速率。

1.4.1 单因素筛选实验

根据文献及先前实验经验总结，共挑选出19个不同因素(棉籽蛋白、甜菜碱、糖蜜、硝酸钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化锌、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、乙酸钠和甘油)进行单因素补料培养基