秦巴山区人巨细胞病毒gN基因型分布及其与宫内感染的关系

秦巴山区人巨细胞病毒gN基因型分布及其与宫内感染的关系
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：许静，李芬，宋晖，张欣文
【摘要】目的探讨陕西秦巴山区母婴人巨细胞病毒(HCMV)感染流行株的包膜糖蛋白gN基因型分布及其与HCMV宫内感染结局的相关性。

方法采用ELISA法检测434例孕期妇女血清中HCMV-IgM及HCMV-IgG，判断秦巴山区孕期妇女HCMV感染情况;采用PCR方法检测孕妇血清和新生儿尿液中的HCMV gN基因，利用限制性核酸内切酶SacⅠ、SalⅠ和ScaⅠ分别对HCMV gN基因进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。

结果①434例孕妇血清中HCMV-IgM阳性35例，阳性率8.06%;HCMV gN DNA阳性25例，阳性率为5.76%。

新生儿尿液中HCMV gN DNA阳性17例，阳性率为3.92%。

在35例HCMV-IgM阳性孕妇中，其配对新生儿尿液HCMV gN DNA阳性11例，HCMV宫内传播率为31.43%。

②42例HCMV gN DNA阳性标本(25例孕妇及17例新生儿)gN3型2例、gN4型40例，8例症状性HCMV感染婴儿与8例无症状性感染婴儿及其母亲均具有相同
的基因型gN4型;1例病理性黄疸患儿与其母亲基因型为gN3。

③新生儿感染症状及预后与基因型之间无相关性。

结论陕西秦巴山区母婴HCMV流行株以gN4型为主。

gN3、gN4基因型可引起母婴传播。

【关键词】人巨细胞病毒;先天性感染;糖蛋白N;基因分型ABSTRACT: ObjectiveTo assess the distribution of human cytomegalovirus (HCMV) glycoprotein N (gN) genotypes in the maternal and infant HCMV infected population in Qinba mountain areas of Shaanxi Province, and to explore the possible relationship between genotypes and clinical outcome of intrauterine HCMV infection.MethodsSerum HCMV-IgM and HCMV-IgG levels were detected by ELISA in 434 pregnant women to determine HCMV infection in pregnant women in Qinba mountain areas. HCMV gN was detected by PCR in the 434 pairs of mother and infant, and gN genotypes were analyzed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis.Results①HCMV-IgM positive rate in sera was 8.06% (35/434) in the pregnant women, and 3.92% (17/434) in the neonates. In the 35 pregnant women with positive HCMV-IgM, 11 were confirmed infected with HCMV in their children urine. The rate of transplacental transmission of HCMV was 31.43 % (11/35). ②Of the 42 cases 40 were grouped into the gN genotype 4, including 8 symptomatic infected infants and 8 asymptomatic infants and their mothers; 1 infant with pathological
jaundice and his mother were grouped into the gN genotype 3. ③There was no correlation between genotypes and the symptoms and prognosis of neonatal infection.ConclusionHCMV gN genotype 4 is a major genotype in maternal and infant infections in Qinba mountain areas of Shaanxi Province; gN3 and gN4 may cause mother-to-infant transmission.
KEY WORDS: human cytomegalovirus (HCMV); congenital infection; glycoprotein N; genotype
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是人类最常见的先天感染病毒之一，在人群中感染率很高。

孕妇感染HCMV后，可通过胎盘或上行性感染垂直传播，导致胎儿宫内感染，引起早产、流产、胎儿生长受限、死胎、胎儿畸形、新生儿并发症及远期的并发症等[1]。

秦巴山区是我国智力低下的高发区[2]。

本课题组既往10年间对这一地区的研究结果显示，该地区孕妇HCMV感染率在19.02%至19.62%之间，明显高于国内外文献的报道[3]。

近年来，从分子水平揭示HCMV的发病机制是研究的热点。

我们在课题组既往研究[4]的基础上，采用聚合酶链反应检测孕妇血清及新生儿尿液中的HCMV 包膜糖蛋白gN基因并进行限制性片段长度多态性酶切分型，以了解当地母婴HCMV感染流行株的HCMV gN基因型分布特点，并进一步探讨HCMV gN基因型与宫内HCMV感染结局的关系，为该地区HCMV感染的预防及疫苗研制提供实验依据。

1资料与方法
1.1研究对象选择2007年5月至2009年11月陕西秦巴山区4个县乡部分医院住院分娩的单胎孕妇共434例作为研究对象。

孕妇年龄20～41岁(中位年龄26岁)，孕周20～39周，其中自然分娩283例，剖宫产151例(均为产科因素);新生儿434例(男性229例，女性205例)。

分娩时采取孕妇肘静脉血5mL，分离血清后-70℃保存以备血清学抗体检测。

所有孕妇均排除其他病原体感染(弓形虫、单纯疱疹病毒、乙肝病毒及丙肝病毒);排除母儿血型不合、妊娠期高血压疾病、心脏病、糖尿病等妊娠合并症;排除智力低下、精神障碍及家族性遗传病史。

新生儿出生2周内采集尿液：新生儿尿道周围清洗后，取中段晨尿3～5mL置干净试管，4℃保存，48h不能完成检测者保存于-80℃备用。

1.2方法
1.2.1血清学抗体检测HCMV-IgG ELISA免疫诊断试剂盒为中国深圳博卡生物技术公司产品;HCMV-IgM ELISA免疫诊断试剂盒为北京现代高达生物技术有限责任公司产品。

操作严格按照说明书步骤进行，每次试验均设定阴性对照和阳性对照。

根据HCMV感染的诊断标准[5]，HCMV-IgM抗体阳性者即为活动性感染。

1.2.2HCMV-DNA检测采用PCR技术。

DNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司，操作严格按照说明书步骤进行。

PCR扩增具体方法参照文献[6]。

1.2.3gN基因扩增及检测PCR所用引物序列：C1：5′-GGCGGTGGTGTGATGGAG-3′和C2：5′
-TTCTGGAAGCAGCAATGTCG-3′，反应体系25μL。

循环条件：96℃变性5min;96℃60s;55℃60s;72℃60s;共35个循环。

最后72℃延伸10min。

20g/L琼脂糖凝胶电泳检测目标片段。

目标基因398bp。

1.2.4PCR-RFLP检测gN基因型扩增后的gN片断分别用限制性内切酶SacⅠ、SalⅠ、ScaⅠ在37℃水浴箱过夜进行酶切，酶切产物以
20g/L琼脂糖凝胶电泳检测目标片段。

3种限制性内切酶(MBI Fermentas公司)按照说明书配制各自反应体系及反应条件。

判断标准参照CHEN等[7]实验结果。

1.3统计学处理采用SPSS11.5软件对数据进行处理，计数资料采用χ2检验(表格中n小于40时采用Fisher精确概率法进行统计学检验)，显著性标准为α=0.05。

2结果
2.1孕妇HCMV血清学检测结果434例孕妇血清学检测结果显示，IgG阳性者为399例，占91.94%;IgM阳性即活动性感染者为35例，为8.06%，其中2项均阳性为23例(表1)。

表1HCMV抗体检测结果
2.2HCMV-DNA检测结果孕妇共434人，血液HCMV-DNA阳性者25例，占所有妊娠妇女的5.76%(其中活动性感染者24例;非活动性感染者1例)。

新生儿尿液DNA阳性者17例，占所有新生儿的
3.92%(其中活动性感染者11例;非活动性感染者6例)。

35例孕妇血
清学检测IgM阳性者相应的新生儿尿液DNA阳性者11例，宫内传播率31.43%。

获得母子配对HCMV-DNA阳性样本共17组。

2.3HCMV gN RFLP分析结果42例阳性(25例孕妇及17例新生儿)均检测出gN，目标基因398bp。

42例阳性标本的gN酶切分型结果为gN3型2例，gN4型40例(图1)。

2.4gN酶切分型与新生儿临床特征之间的关系17例先天性感染新生儿中无症状感染8例，病理性黄疸5例，胆道闭锁1例，全身性感染2例，肺炎1例。

新生儿中仅病理性黄疸1例与母亲的基因型为gN3型，其余均为gN4型。

分析基因型与疾病之间的相关性，未发现基因型分布与疾病表现及预后之间存在相关性(P=1.000，表2)。

图1gN基因产物RFLP分析结果Fig.1 RFLP analysis of the gN sequence obtained from HCMV clinical samples1：100bp Marker;
2、3、4：gN3;5、6、7：gN4;8：50bp Marker。

样本分别被SacⅠ(2、5)，SalⅠ(3、6)和ScaⅠ(4、7)酶切消化。

表2gN基因分型与新生儿临床特征之间的关系
3讨论
gN是Ⅰ型跨膜糖蛋白，由HCMV的开放读码框架(ORF)UL73编码，与致密颗粒基质以及病毒包壳一样，在病毒复制循环的后期在细胞质以及被感染的细胞膜上表达。

针对gN蛋白的抗体可以中和HCMV的感染。

gN与包膜糖蛋白M(gM)通过二硫键连接而形成复合体gC-Ⅱ。

有研究认为gN是HCMV中最具有多态性的一种糖蛋白[8]。

它与gO(一种gC-Ⅲ复合体的组成成分)一起，在病毒进入以及细胞融
合中发挥作用。

关于gN基因型分布特点，目前研究结果尚不一致。

意大利学者PIGNATELLI等[9]利用其设计的引物，在先天性感染的婴幼儿中区分了4种主要的HCMV gN基因型，以gN4占主要优势，其次为gN1和gN3，而gN2极其少见，并指出gN基因型在世界范围内其分布无差异性。

但是，CHEN等[7]应用自己设计的引物对台湾地区巨细胞感染人群进行研究，结果与PIGNATELLI不一致。

他们区分4种基因型，并且指出HCMV gN2型并不少见，并认为基因型检出的差异是由于引物设计的不同。

本研究应用CHEN等[7]设计的引物对中国陕西秦巴山区巨细胞感染人群的研究结果与PIGNATELLI基本一致。

本研究中，42例DNA阳性标本中，gN4占到95.24%(40/42)，gN3为4.76%，gN1和gN2未检出。

在PIGNATELLI等[10]结果中由中国获得的20例标本中未检出gN2。

本研究同样没有检出gN2和gN1型。

分析其原因，可能是该gN基因型存在地区、种群及人群的区别，也可能与我们研究的样本量小有关。

本实验直接选取研究对象的血液和尿液进行检测，并没有像国外研究那样进行临床菌株的细胞培养，这也避免了在细胞培养过程中病毒基因发生变异的可能性。

当然，由于没有进行分离培养，对一些不典型的变异株可能无法筛出。

提示关于秦巴山区这一基因的基因型分布仍有待于进一步研究。

分析新生儿临床症状与基因型分布之间的相关性，并未发现存在显著相关性。

本课题组王芳等[4]的研究结果显示糖蛋白B基因(gB)的基因型分布与国内外研究基因型分布结果不一致。

结合本研究对
gN基因型分布的研究结果，均提示HCMV的基因型存在地域以及人种的差异。

本研究检出的两型基因型均可引起先天性感染，且基因型分布与疾病的临床表现及严重程度和转归之间无相关性。

本研究并没有发现gN1和gN2型，而在无症状感染中，仍然是gN4占有绝对比例。

这与PIGNATELLI等[10] 研究提出的“gN1型在无症状感染组占有优势，gN1型病毒具有低毒性，并且临床预后相对较好”的结论也存在差异。

这也提示对于该基因型与疾病之间的相关性还有待于扩大样本进行进一步的研究。

在感染的17例新生儿中，有8例是无症状感染。

基于课题组张欣文等[11]既往的研究结果，对这一群体仍然需要进一步的随访观察，以发现隐匿型感染及先天性感染的远期后遗症，尤其是感觉神经性耳聋、智力低下等，以便适时干预，避免不良预后。

近年来，有报道HCMV宫内感染为多种基因协同作用的结果[12]。

欧美各国针对gB基因多态性、HCMV UL144基因多态性与先天性HCMV感染结局的研究均提示HCMV毒株的毒力和致病性并非简单的与单独一个基因的变异相关，进一步证实HCMV宫内感染由多个基因的协同作用决定[13-15]。

继续深入研究HCMV宫内感染的发生机制，以有效预防控制HCMV感染，提高秦巴山区出生人口的素质。

【参考文献】
\[1\]刘瑾，顾晓慧，叶国玲，等. 孕妇TORCH感染与胎儿畸形的关系\[J\]. 第四军医大学学报, 2004, 25(18):1682-1685.
\[2\]张富昌，李瑞林，高晓彩，等. 秦巴山区(宁强、柞水、安康试验区)0～14岁儿童精神发育迟滞患病状况调查\[J\]. 第四军医大学学报, 2004, 25(6):511-514.
\[3\]李芬，闫凤亭，韩蓁，等. 秦巴山区孕期巨细胞病毒感染状况分析\[J\]. 中国公共卫生, 2003, 19(5):528-529.
\[4\]王芳，李芬，于学文，等. 秦巴山区HCMV感染母婴垂直传播与HCMV gB基因分型的关系\[J\]. 第四军医大学学报, 2006, 27(15):1428-1430.
\[5\]中华医学会儿科学分会感染消化学组. 巨细胞病毒诊断方案\[J\]. 中华儿科杂志, 1999, 37(7):441.
\[6\]李芬，闫凤亭，韩蓁，等. 贫困山区孕期CMV感染与IL-6的关系\[J\]. 西安医科大学学报, 2002, 23(2):196-197.
\[7\]CHEN HP, LIN JC, YANG SP, et al. The type-2 variant of human cytomegalovirus glycoprotein N (gN-2) is not the rarest in the Chinese population of Taiwan: Influence of primer design \[J\]. J Virol Methods, 2008, 151(1):161-164.
\[8\]PATERSON DA, DYER AP, MILNE RS, et al. A role for human cytomegalovirus glycoprotein O (gO) in cell fusion and a new hypervariable locus \[J\]. Virol, 2002, 293(2):281-294.
\[9\]PIGNATELLI S, DAL MP, ROSSINI G, et al. Intrauterine cytomegalovirus infection and glycoprotein N (gN) genotypes \[J\]. J Clin Virol, 2003, 28(1):38-43.
\[10\]PIGNATELLI S, DAL MONTE P, ROSSINI G, et al. Human cytomegalovirus glycoprotein N (gpUL73-gN) genomic variants: identiflcation of a novel subgroup, geographical distribution and evidence of positive selective pressure \[J\]. J Gen Virol, 2003, 84(Pt 3):647-655.
\[11\]ZHANG XW, LI F, YU XW, et al. Physical and intellectual development in children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection: A longitudinal cohort study in Qinba mountain area, China \[J\]. J Clin Virol, 2007, 40(3):180-185.
\[12\]JI YH, RUAN Q, SUN ZR, et al. Structure and variability of the UL149 open reading frame from low-passage
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clinical isolates of human cytomegalovirus \[J\]. J Virol Methods, 2006, 131(1):72-77.
\[13\]PICONE O, COSTA JM, LERUEZ-Ville M, et al. Cytomegalovirus (CMV)glycoprotein B genotype and CMV DNA load in the amniotic fluid of infected fetuses \[J\]. Prenatal Diagn, 2004, 24(12):1001-1006.
\[14\]AHUMADA RS, TAYLOR CL, VISONA K, et al. Determination of human cytomgalovirus genetic diversity in different patient populations in Costa Rica \[J\]. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 2004, 46(2):87-92.
\[15\]PICONE O, COSTA JM, CHAIX ML, et al. Human cytomegalovirus UL144 gene polymorphisms in congenital infections \[J\]. J Clin Microbiol, 2005, 43(1):25-29.。