红曲霉生产洛伐他汀的技术发展

红曲霉发酵生产Monacolin K的工程技术研究进展
摘要：红曲的药用价值和保健功效日益引人关注，其中洛伐他汀作为红曲主要的调脂因子成为科研热点和红曲产业发展的重点。

概述红曲洛伐他汀的发现、用途、生产方法、提纯、检测方法、毒性物质问题以及生产现状进行综述。

关键词:红曲霉、洛伐他汀、检测、提取、桔霉素
1.前言
1.1 Monacolin K的发现及结构式
Monacolin K是目前较好的降低人体血液中胆固醇的药剂,具有降胆醇、降血脂的作用,又叫洛伐他汀(lovastatin) ,存在于红曲霉及其它真菌如Pleurotus，Phoma，penicillium中。

生产所使用的菌种主要有两类:红曲霉和土曲霉,东方国家如日本及我国多采用红曲霉,欧美等国的研究多采用土曲霉川,最近几年,美国也开始意识到中国食品红曲中的药用价值。

其结构式为：
分子式为C24H36O5,Mr为404。

1979年,日本学者远藤章首先从红色红曲霉菌Monascus ruber中发现某些能产生强力抑制胆固醇合成的活性物质,命名为Monacolin K, Monacolin K 类物质不仅可以降低胆固醇,而且对重症胆固醇血症患者也极为有效,特别是对导致动脉硬化最严重的低密度蛋白胆固醇有优先降低的作用,其中以Monacolin K抑制HMG一COA还原酶的活性最高川。

1980年,美国Albert等从土曲霉中发现了与Monacolin K相同的物质侧,命名为mevinolin,现称作洛伐他汀(Lovastatin)。

但是采用土曲霉发酵,菌株的安全性对下游工程的技术要求较高,因此提取收率较低。

由药用红曲霉制成的制剂具有较强的降血脂能力,副作用较低于Lovastatin制剂。

近些年来,我国开展了红曲霉降血脂生理活性物质的研究。

1.2 Monacolin K的基本性状见表1。

1.3Monacolin K抑制胆固醇合成的作用机理
生物化学的研究表明,胆固醇合成的关键步骤是甲经戊酸的合成(见结构式)。

其中影响最大的是3一羟基一3甲基一戊二酰CoA〔HMG一CoA〕还原酶,它是胆固醇合成代谢中的限速酶,各种因素对胆固醇合成的调节主要是通过对HMCCoA还原酶活性的影响来实现的。

Monacolin K的空间结构与HMG一CoA的结构非常相似,且对HMG一CoA还原酶的亲和力比HMG一CoA强1万倍,所以它能竟争性地与IIMG一CoA还原酶结合,从而抑制胆固醇合成。

这类物质的浓度只要达到0.001一0.005μg/ml,胆固醇的合成就会受阻,即人体血液中含有MOnacolin K在1一5μg/L时会产生降低胆固醇功效阁。

成年人血液量为20L,所需Monacolin K有效剂量为100μg,若菌株MonacolinK发酵液含量为47.1μg/ml,服用3而发酵液即可满足要求[1]。

2.功能红曲的生产方法
2.1固态发酵
传统红曲生产工艺主要是以大米为固态培养基，接种红曲菌菌种后通过发酵生产红曲。

该方法工艺落后，劳动强度大，红曲产量低，质量不稳定，并且易受杂菌污染。

80 年代后，通风池法应用于红曲的生产，红曲产量和质量相对提高。

圆盘制曲机的应用实现了红曲的自动化生产，并提高了红曲质量，在一定程度上减少了杂菌污染。

传统红曲发酵工艺由于未能有效控制通风、温度、湿度等重要发酵条件，因此，所得红曲的色价和活性成分较低，且桔霉素污染严重。

刘昕[2]提出在固态发酵中，代谢产物Monacolin K 在红曲菌菌丝体生长后期的积累达到最大。

同时，由于淀粉质固态培养基料被红曲菌分泌的淀粉酶和糖化酶液化而出现基料通气环境恶化，菌丝体细胞壁被高渗透压葡萄糖液浸润，从而使其生长代谢出现变态反应，促使桔霉素的生成以抑制其它杂菌的生长。

因此他提出了一种通过调控红曲菌培养过程中的培养温度、湿度及通风量来抑制桔霉素生成的方法，所获得的功能性红曲中Monacolin K 含量高且未检测出桔霉素。

王立新等[3]认为固态发酵法较液体发酵法具有明显的优势。

在确定的实验条件下，固态发酵法所得的Monacolin K 产率为液体发酵法的20 倍以上。

因此在掌握固态发酵规律的基础上，设计合理的固态发酵反应系统，实现高效低耗的固态发酵生产，是功能性红曲产业化生产的有效途径。

同时，该研究表明固态发酵过程中物料的初始含水量以50%为宜。

含水量较高时，糖化酶活性增强，从而提高培养基料的糖化速率，不利于红曲中Monacolin K 的积累。

培养温度对促进红曲菌发酵过程中Monacolin K的生成十分重要。

恒温培养可获得比
变温培养更高收率的菌体量和色素，而变温培养的Monacolin K 产量更高。

实验研究表明，在32°C 温度下培养9 d 后，将温度降至25°C 下培养14 d，则更有利于Monacolin K的积累[4]。

红曲为好气性菌，其菌丝体的生长和Monacolin K等次生代谢产物的产生都需要有足够的氧气。

因此，适宜的溶解氧水平是一个非常重要的参数，它直接影响红曲中Monacolin K 和桔霉素的含量。

提高通风量有利于菌体生成和Monacolin K 的产生，但同时桔霉素的含量也增加。

因此，在满足溶氧需求的情况下，可采用低通风量[5]。

固态发酵法是目前红曲生产中广泛采用的方法，具有投资少，产量大，生产经验丰富等优点。

现代固态发酵工艺的关键是控制发酵过程中菌种质量及物料含水量、通风量、培养温度及湿度等参数，通过现代技术优化和改造发酵工艺，可望有效生产富含活性成分Monacolin K 且不含桔霉素的功能性红曲。

2.2液态发酵
液态发酵法发酵红曲主要以淀粉、葡萄糖、甘油、黄豆粉、玉米浆和蛋白胨等为培养基，采用常规标准深层发酵设备，如机械搅拌发酵罐等。

近年来开发的适宜于高粘度发酵体系的气升式反应器，将更加有利于发酵过程的进行。

液态发酵法培养基的碳源、氮源、初始pH 值及溶氧量等是关键的工艺控制参数。

碳源以甘油最好，葡萄糖次之。

有机氮源中肉膏和蛋白胨优于酵母膏，无机氮源则以NaNO3较好。

C/N 比值是十分重要的控制因素，它不仅影响前期菌丝体的生长，而且对后期代谢产物的形成和积累也非常重要。

实验结果表明，当C/N 比为5:33 时，Monacolin K 的产量较高[6]。

赵树欣等[4]认为培养基的初始pH值对Monacolin K的生成也有明显影响，当pH 为6.0~6.5 时最为适宜。

许赣荣等[7]对经过筛选低产桔霉素的一株红曲菌菌种进行液态发酵法培养，选用玉米淀粉和谷氨酸单钠盐为主要成分的培养液，所获得的红曲菌发酵液中桔霉素浓度低于1mg/ml。

此外，溶氧条件对红曲菌产生桔霉素的影响的研究结果表明，高溶氧对桔霉素的
产生有促进作用。

Blanc 等[8]研究发现，在液态深层培养红曲的过程中添加6至18碳脂肪酸和甲基酮会影响红曲中桔霉素的生成，尤其是辛酸和2-三十碳酮可使桔霉素的生成量减少75%。

杨胜利等[9]研究发现，应用超声波技术可提高红曲菌发酵过程中Monacolin K 的产量。

正常情况下红曲菌落呈团状，氧和营养物质不易吸收，也不利于代谢产物的生成。

采用超声波处理可使菌丝体分散，甚至成为游离的单菌体，从而有利于菌体的代谢和活性物质的分泌。

同时，超声波处理还可降低发酵液的粘度，有利于氧气和营养物质的传递。

实验结果显示，当超声处理时间为 2 min 左右时其效果最佳，既不引起细胞死亡，又能显著提高Monacolin K 的产量。

液态发酵法所用基质的混合和扩散较为均匀，有利于氧气和其它营养成分的传递与扩散，且易于添加某些特定成分以抑制桔霉素的生成。

但目前国内采用液态深层发酵法生产的红曲发酵液中，Monacolin K含量较低且不稳定，甚至出现依靠添加由土霉素发酵获得的Monacolin K 或直接添加合成药物洛伐他丁来控制产量的现象。

因此，红曲的液态发酵工艺及产品质量控制需进一步加以规范。

3提取工艺
国际上对洛伐他汀的首次报道来自A.Endo. 1976年,东京大学酵实验室的Akira Endo从泰国食品中分离出来Monascus菌株(Monascus-rubberNo.1005),经发酵产生洛伐他汀.其培养基组成为:6%葡萄糖、2.5%蛋白胨、0.5%玉米油、0.5%氯化氨.经28e需氧培养10 d,所得发酵液经处理可得到无色的洛伐他汀晶体.其提取工艺见图1.
图1 最早的洛伐他汀提取工艺
但该工艺多次采取溶媒萃取法,并大量使用有害溶媒,对劳动者及环境都会造成极大危害。

王健[10]等通过实验研究确定了从洛伐他汀发酵液中提取洛伐他汀的最佳工艺条件。

实验表明乙醇作为溶剂时，其最佳工艺条件: 浸提温度45℃，物料比5∶1(乙醇/mL∶菌丝/g)，浸提时间4h，闭环温度80℃，闭环时间5h。

本工艺简便、收率高，适用于工业化生产。

周慧[11]等提出了采用超临界CO2流体萃取，95％乙醇超声洗涤纯化的方法。

通过实验确定优化萃取工艺为萃取压力25 MPa、萃取温度55 ℃、夹带剂用量2.0 mL·g－1、萃取时间100 min；优化纯化工艺为95％乙醇为洗涤溶剂，洗涤4次，每次用量2 mL·g－1，所得洛伐他汀纯度＞98％。

该方法的优势在于摒弃了大量有机溶媒，仅使用乙醇一种溶剂，不会对人体及环境造成危害；工艺简便，省去了结晶与重结晶步骤；降低了成本，适合工业化生产的需求。

4洛伐他汀分析检测方法
4.1 硅胶薄层层析法测定（TLC）
毛宁等[12]通过实验发现，若用发酵滤液粗提浓缩物，最终提取结晶以及结晶剩下的滤液点样，用薄层层析检测结果几乎一致，因此只需对发酵滤液粗提的浓缩物进行薄层层析定量或定性检测。

TLC定性试验：取硅胶GH25420g，加0.5%CMC Na50ml，用铺板器铺成1mm厚，20cm×20cm的薄层板，室温晾干，105℃活化1h，置干燥器中备用。

展开剂：二氯甲烷：丙酮（9：1），称取固态样品5g，用100ml乙酸乙酯在索氏提取器上回流提取1h，提取液浓缩至5ml，取50μl点样，或直接取发酵滤液粗提浓缩物50μl点样，同时用Monacolin K 标准品（美国Merch公司）点样作对照，展开15cm，取出晾干，紫外灯下观察斑点位置。

Monacolin KRf值应为0.47，分别挖取与标准品相同Rf值的斑点和相同面积的空白硅胶作参照，置10ml具塞试管中，加乙酸乙酯5ml，剧烈振荡2min，2000r/min离心15min，取上清液低温蒸干，加5ml环已烷重新溶解，观察在200～300nm范围内的紫外吸收图谱，Monacolin K在231nm，238nm及247nm下有特征吸收峰。

TLC定量分析：精密称取标样适量，加乙酸乙酯配成1ml含10mg的溶液，精密吸取该液5，10，15，20，25μl点于薄层板上，展开，分别刮取Monacolin K斑点和相同面积的空白硅胶，按以上制成环乙烷溶液，在247nm下测定光密度。

标准样的微克数与光密度分别为横，纵坐标作标准曲线。

按以上将样品提取液50μl点于同一板上，将斑点取下制成环乙烷溶液测定光密度，根据光密度从标准曲线上查得对应的Monacolin K的μg数。

4.2 HPLC定性加定量检测
高嘉安[6]等用高效液相色谱仪检测粗提浓缩物，出现多个杂质峰，它们的位置远离Monacolin K峰，对测量值没有影响，因此只需对发酵液的粗提浓缩物进行检测。

所用仪器为Beckman126型高效液相层析仪，分离管为0.76cm×30cm，C18μm Bondapak微径管柱，流动相为79%甲醇和21% 磷酸，流速1ml/min，紫外检测波长：237nm，标准品同上。

如何对发酵样品进行简便有效的预处理是定量分析的一个关键问题。

发酵液的预处理方
法:取6mL发酵液,加入14mL甲醇,摇床振荡(30℃,200rpm)2.5一3h后,离心(8000r/min)20min,上清液用有机滤膜过滤后进样。

文镜[13]等建立了用RP-HPLC-PDA检测器测定功能红曲中Monacolin类化合物总含量的检测方法，其优势是能够在缺乏Monacolin化合物标准样品的情况下对功能红曲中Monacolin 类化合物进行定性、定量分析。

用75%乙醇超声提取功能红曲中的Monacolin类化合物，高效液相色谱仪以甲醇∶水∶磷酸=385∶115∶0.14（v∶v∶v）为流动相，用反相C18柱（4.6×250mm，5μm）分离提取液中的Monacolin类化合物，并用二极管阵列检测器检测。

在此实验条件下，功能红曲提取液中各Monacolin类化合物能够得到良好地分离。

用检测器同时给出的各Monacolin类化合物紫外吸收光谱图定性，用外标法根据各Monacolin类化合物峰面积定量。

对方法的准确度、精密度、线性关系进行考察；对5种功能红曲样品进行检测均取得良好结果。

5桔霉素
在红曲霉发酵晚期，易产生次级代谢产物桔霉素，桔霉素是毒性很强的真菌毒素，对肾脏有毒害作用，而且还发现有致畸作用，但并非所有的红曲菌都会产生桔霉素，例如；日本用从毛红曲霉，红色红曲霉，单色红曲霉可以生产出不含桔霉素的产品，而且桔霉素的产生与否与生产方法有关，生产工艺条件还决定桔霉素的含量，例如许赣荣等筛选得到数株低产桔霉素的红曲菌种。

由此看来，只要筛选出合适的菌种并优化发酵工艺，使桔霉素的产生受到抑制，得到高的Monacolin K含量而且不含或少含桔霉素的红曲产品是可能实现的。

也有人认为红曲霉发酵产品是一种混合物，不能认为因为其中存在桔霉素，就否定红曲制药的正常作用，其剂量本来就小，在一定的范围内，人体食用仍然是安全的[14]。

目前红曲中桔霉素的检测方法主要有HPLC-紫外检测法、HPLC-荧光检测法、酶免疫法等。

紫外检测的最低检测浓度通常为1mg/ml，而荧光检测的最低检测限可达0.60ng，更适用于功能性红曲中微量桔霉素的检测。

酶免疫法测定桔霉素灵敏度亦较高，但所需试剂价格昂贵，未能普及应用[15]。

样品预处理对于减少色素在桔霉素测定中的干扰亦很重要。

许赣荣等[16]以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7:3:1）为提取溶剂，将红曲样品超声波提取 3 次后，桔霉素的提取效率最高，同时提取的红曲色素最少，为准确检测功能性红曲中的微量桔霉素提供了较好的样品预处理方法。

6国内外工业化生产状况
1987年美国开发新一代降胆固醇药物--美降之投放市场，并于1989年进入中国，随后美国开发了vastatin系列降胆固醇药物，其主要成分就是Monacolin K或J。

受日本、美国研究工作和中国历代对红曲药用功效的启示，1991 年，张茂良等人开始了对红曲的研究。

1995年开发出新型天然降血脂药物--血脂康，该药利用红曲发酵后的综合提取物制成，未对发酵产物进行提纯，除含有降胆固醇物质Monacolin K外，还保留其他多种有效成分。

同年，中国科学院成都地奥制药公司生产的脂必妥片，是一种新型的中成药，主要成分是红米曲。

近年来，高血脂以及相关的心血管疾病已成为影响我国人民身体健康的主要疾病之一，全国血脂偏高的病人高达800万人，引起这些疾病的主要因素是高胆固醇，对含Plonacolin K类药物目前我国刚开始生产，在产率和提取得率上与发达国家有较大的差距，而且副作用普遍反映较大，此类药品主要靠进口，价格较贵，如美国生产的Lovostatin，年销售额高达20亿美元。

因此，加大对Monacolin K的研究开发具有重要的现实意义。

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