间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用 (2)

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CpG binding protein
间充质干细胞外泌体的保存条件 外泌体膜因表面富含鞘磷脂和胆固醇的脂筏结构,因此在
低温下可以抵挡非离子去垢剂,保护内含物不被降解。 Sokolova等E16]通过纳米粒子跟踪分析证实,间充质干细胞外泌 体可以在--20℃的条件下长期保存而不被降解,而在4℃和 37℃条件下,外泌体会缓慢降解,其中37℃放置2 d,4℃放置
Yan Bingha01,Zhang Yanl,Fang
Shu02,Wang
Yuea,Liu Houqil△
(1.Translational Medicine Institute,2.Department of Plastic Surgery,Changhai Hospital, 3.Department of Histology and Embryology,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
关,miR-10a和miR-22与调节间充质干细胞分化有关。tRNA
半分子也是在间充质干细胞外泌体中高表达的一种小分子 RNA。在不同状态下的间充质干细胞,其外泌体携带的tRNA 半分子也各不相同。在已经分化的间充质干细胞和脂肪细胞 中,tRNA半分子在5’端存在特征序列GCC(Gly)和CTC
(Glu)E 8。,有研究表明这些CTC(Glu)序列可能发挥着类似于
r/min离心条
件下离心10~30 min即可,此方法简单、省时,且不会破坏外泌 体的结构,但分离得到的外泌体纯度不高Ll
2。。
肌内注射低氧环境培养的间充质干细胞外泌体可以显著改善血
流循环,减少心肌梗死面积。Zhang等[1刚报道脐带来源的间充 质干细胞外泌体可通过Wnt4/p-catenin通路促进血管的生成, 具体机制可能是通过外泌体内含的无翅型MMTV整合位点家 族成员4(recombinant
CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V01.39 No.5 2016
解剖学杂志2016年第39卷第5期
间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用
严冰浩1 张燕1
方硕2
王越3
刘厚奇1△
(第二军医大学,1转化医学院,2长海医院整形外科,3组织学与胚胎学教研室,上海200433)
Preparation and application of exosomes derived from mesenchymal stem cells
300
本特征。Lai掣¨3通过类似的实验,证实了在小鼠缺血再灌注
模型中,给予间充质干细胞外泌体可以有效改善心肌损伤,使心 肌梗死面积减少40%。Arslan等[163进一步证实,通过给予一次 性静脉注射间充质干细胞外泌体,可以有效减少心肌梗死面积, 通过观察可见在心肌损伤部位,间充质干细胞外泌体直接参与 了内吞过程,而其中的关键物质可能是磷酸化的蛋白激酶B
(RAC-alpha
r/rain
离心至少16 h,使外泌体沉降到1.12~1.24 g/ml的等密度层, 通过收集该密度层的悬液,即可得到外泌体。用此法收集的外 泌体纯度较高,但操作比较费时。
间充质干细胞外泌体还可以通过凝胶色谱法来收集,此方
法需要两个操作步骤,首先将培养基上清在低重力离心条件下 通过0.2灶m滤膜来除去分子量超过100 kD的大分子蛋白质, 然后将滤过的悬液通过排阻色谱,大分子的物质首先被洗脱下 来,最后被洗脱下来的为外泌体,此法得到的外泌体与超速离心 得到外泌体纯度相当,但操作费时、复杂L】州1。。 超滤法是利用dqL径的超滤膜离心分离外泌体,先低速离 心以去除上清液细胞碎片和蛋白质沉淀,在3
间充质干细胞是一类多能干细胞,来源于发育早期的中胚 层和外胚层,可以在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉和脐带等多种 组织中分离,经诱导后可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧 带、神经、肝、心肌和内皮等多种组织细胞[1]。过去,常常认为间 充质干细胞可巢居到受损部位后直接定向分化为靶细胞来发挥 作用。然而,有研究表明,间充质干细胞巢居到损伤部位的比例 和分化为靶细胞的数量都是非常有限的,而且分化为所需靶细 胞的这一过程非常短暂,与观察到的治疗效果在时问上互相矛 盾。现在越来越多的研究倾向于认为间充质干细胞主要通过旁 分泌机制来分泌多种细胞因子作用于其他细胞来发挥作用[2]。 外泌体是一种直径在40~100 nm的脂质双分子层囊泡,最早在 1983年研究羊的网织红细胞成熟过程中分泌的囊泡而提出,其 可携带细胞特异表达的蛋白、脂质和核酸等物质,然后通过与细 胞的接触直接将所携带的物质传递给邻近或者远距离的细 胞[3]。目前大量研究表明,间充质干细胞来源的外泌体可以通 过其内容的蛋白、RNA成分胞间转移,发挥与间充质干细胞相 类似的组织修复、免疫抑制、调节免疫功能等作用。并且与细胞 治疗相比较,外泌体性质更稳定,保存运输方便,没有移植细胞 带来的免疫排斥反应和肿瘤形成风险,因此有望成为一种新的 治疗策略。现将间充质干细胞来源的外泌体的基本特征、制备 方法和在疾病中的应用进行综述。 1间充质干细胞外泌体的结构与组成 外泌体是一群直径在40~100 nm之间,密度在1.13~
2间充质干细胞外泌体的提取、保存与鉴定
2.1
间充质干细胞外泌体的提取方法 间充质干细胞来源的外泌体可以通过收集间充质干细胞上
清来获取,主要提取方法有超速离心法、凝胶色谱法、超滤法、免
doi:10.3969/j.issn.1001—1633.2016.05.026
疫磁珠法和试剂盒提取法。 间充质干细胞外泌体可以通过超速离心的方法获得,通过 逐步提高离心速度来去除细胞上清中的细胞碎片和蛋白质沉淀 后,在不少于37

2,MECP2)来减少心肌组织纤维化。Yu
等[2u研究表明间充质干细胞外泌体通过其高表达的miR-221, 减少由于筇3上调引起的心肌细胞凋亡。 3.2肾损伤 间充质干细胞外泌体可以用于治疗缺血、有机毒物等引起 的急性肾损伤。Hu等旧2]研究表明间充质干细胞通过抑制T细 胞中的炎性细胞因子,促进缺血组织内调节性T细胞的再生,改 善急性肾损伤。有不少学者认为间充质干细胞可能通过旁分泌 作用参与了肾脏损伤修复。研究表明,间充质干细胞分泌的细 胞因子如白细胞介素一1(interleukin-1,II,1),白细胞介素一4 (interleukin-4,IL-4),白细胞介素一5(interleukin-5,II,5),白细 胞介素一6(interleukin-1,II,6)等),生长因子如血管内皮生长因 子(vascular

之间的囊泡就是外泌体。外泌体的膜含有丰富的胆固醇、甘油 磷脂、鞘脂和神经酰胺等物质,并且有着与细胞膜结构类似的腔 内和跨膜蛋白_4j。 外泌体含有丰富的蛋白质、脂质、核酸等物质,其中认为功 能比较明确的主要有蛋白质和核酸(mRNA、miRNA、tRNA
7UTR区,但是否能够发挥功能和其具体机制还尚未证实。
白是共同存在的,其他的蛋白存在细胞特异性。对这些蛋白进
行聚类分析后显示不少蛋白都有生物学效应,有潜在的治疗疾 病的可能。 外泌体内的核酸主要有mRNA、miRNA、tRNA、snoRNA、
vault RNA、Y
RNA等。其中miRNA在外泌体中也呈现了细胞
特异性,miR~143—3p,miR一10b-5p,miR-486—5p,miR-22—3p,miR一 21—5p是在间充质干细胞外泌体中高表达的5种miRNA[8I,研 究表明miR-143与脐带来源的间充质干细胞的免疫调节功能有
g/ml之间的脂质双分子层结构囊泡。外泌体的产生在内
涵体中,首先在细胞膜出芽过程中形成了早期核内体,然后早期 核内体随内胞膜二次出芽形成晚期核内体,最后,晚期核内体与 细胞膜融合,以胞吐的形式排放出囊泡,那些直径在40~100
nrn
miRNA/siRNA的沉默mRNA作用[9],已知这些tRNA半分子 可以靶向调节分化、增殖的一些基因如(runx2、samd3)的
2.2
MMTV
integration
site
family member 4,WNT4)促进了B一链蛋白([3-catenin)的核转
位,使增殖核抗原细胞周期素D3(cyclin D3),神经一钙黏素(N- cadherin)和13-catenin的表达增加。其促血管生成作用在干扰 wnt4后得到了抑制,并且,加入la-catenin的抑制剂ICG-001也 可抑制血管的生成。 间充质干细胞外泌体在调节心肌功能中也有非常重要的作 用。Feng等[20]研究表明间充质干细胞外泌体可以改善心肌缺血 后心功能的恢复,其中起了关键作用的物质是间充质干细胞外 泌体内的miR-22,通过识别结合甲基CpG结合蛋白2(methyl
000
serine/threonine-protein kinase,PKB)和磷酸化的
synthase
糖原合成酶激酶一3(glycogen
kinase-3,GSK-3f3)。
有研究表明低氧环境下培养的间充质干细胞所释放的外泌 体可以促进血管的生成,具体原因可能是低氧条件下间充质干 细胞激活了缺氧诱导因子家族蛋白质的表达口…。Bian等[18]证 实将收集的低氧环境培养的间充质干细胞外泌体以80 gg/ml 的浓度与脐带静脉内皮细胞共培养时,可以显著提高脐带静脉 内皮细胞的增殖和迁移能力,促进血管的生成,效果与添加血管 内皮生长因子相当。通过构建急性心肌梗死大鼠模型,给予心
wingless
type
免疫磁珠法是通过利用抗原抗体反应,设计能够识别间充 质干细胞外泌体表面的特异性标志物(如CD9、CD63等)抗体的 磁珠‘”],通过磁珠抗体与外泌体共同孵育使之结合并使之分离 的方法。此方法操作简单,分离得到的外泌体纯度较高,但分离 过程中的非中性pH环境和非生理性渗透压浓度可能会破坏外 泌体结构,影响外泌体生物学活性。 另外,近年来市场上也出现了不少商品化的外泌体抽提试 剂盒,主要原理是通过排阻色谱和化合物共沉淀等方法对外泌 体进行纯化分离,为抽提外泌体提供了一种新的方法。与传统 的制备方法相比,商品化抽提试剂盒方便快捷,纯度和产率也更 高,但价格比较昂贵,不适合大量抽取外泌体。
1.19
等)。目前已经在外泌体中发现了超过1 600种蛋白,既有外泌 体普遍存在的蛋白,也有细胞特异性表达的蛋白[5]。普遍存在 的蛋白主要有:跨膜四超蛋白家族(CD63、CD81)、整合素、免疫 球蛋白、生长因子受体、骨架蛋白(微管蛋白、肌动蛋白)、凋亡连 接基因2相互作用蛋白X(apoptosis-linked
protein
gene gene
2-interacting susceptibility
X,3,1ix)、肿瘤易感基因101的蛋白质(tumor
101,TSGl01)、热休克蛋白(HSP70、HSP90)[6]。间充质
干细胞来源的外泌体能特异性的表达CD29、CD44、CD73等一 些在间充质干细胞膜上特异性表达的蛋白。不同来源的间充质 干细胞分泌的外泌体,携带的蛋白成分也是不尽相同的。Lai 等[7]通过液相色谱一质谱联用分析三簇不同间充质干细胞来源 的外泌体,分别检测到了379、432、420种蛋白,而只有154种蛋
300
第1作者Ermail:yanbinghao 502@163.com △通讯作者,E—mail:houqiliu@126.COrn 收稿日期:2016—01—30;修回日期:2016—06—30 —————622・--——
r/min的离心力下离心至少2 h,即可初步
万方数据

得到外泌体。此步得到的外泌体纯度不高,混有大量微泡和凋 亡小体等,所以仍然需要通过蔗糖梯度离心来进一步纯化,通过 预制不同浓度的蔗糖溶液配成连续梯度体系,以37
endothelial growth growth
d会导致外泌体显著降解。因此,操作外泌体的时候要尽量注
意在低温环境下进行,并减少外泌体反复冻融,外泌体即可以在 -20℃条件下长期保存。 2.3间充质干细胞外泌体的鉴定方法 间充质干细胞外泌体的直径在40~100 nrn之间,可以通过 电子显微镜、纳米粒子跟踪分析等方法直接进行观察。另外,可 以利用间充质干细胞外泌体的一些表面标志物如CD81、CD9、 TSGl01、ALIX等,通过微流式细胞分析仪、免疫印迹分析、酶联 免疫吸附试验进行检测。
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