动物细胞培养技术PPT课件
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第十二章：动物细胞培养技术
• 第一节 体外培养动物细胞的生物学特征
• 第二节 动物细胞体外培养技术
• 第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定
• 第四节 细胞同步化
• 第五节 器官培养
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动物细胞培养技术
动物细胞培养是用无菌操作的方法将动物体 内的组织或器官取出，模拟动物体内的生理 条件，在体外进行培养，并观察细胞的生长， 发育及衰老等生命现象的技术。动物细胞培
当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少， 代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的
影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。
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三、培养细胞的增殖能力
体内细胞生长处于动态平衡环境中，而体外培养细胞的 生存环境是培养瓶、培养皿或其他容器。生存空间和营养 是有限的。当增殖到一定密度时，则需分离出一部分细胞 并跟新营养液，否则将会影响细胞的继续生存，这一过程
称传代
（一）培养细胞生命期、
培养细胞生命期是指细胞在体外培养条件下持续增殖和 生长的时间。正常细胞在体外培养时，不论细胞的种类和 供体的年龄如何，在细胞生存全过程中，基本经历以下三
个阶段。
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1、原代培养基
原代培养基也称初代培养基，即从动物机体内取出组织接种培养到第一 次传代阶段，一般持续一到四周。此期的细胞移动活跃，可见细胞活 跃，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养的细胞于体内相应的细胞性 状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。
2、传代期
初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。此期最长，细胞增殖旺盛， 能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二 倍体细胞性质应在初代培养期或传代后早期冷冻。如不冷冻则要反复 传代。一般，传代十至五十次左右，细胞增殖逐渐减慢，甚至停止， 进入衰退期。
3、衰退期
衰退期的细胞虽然能存活，但增殖很慢并逐渐停止，进而发生衰退死亡
1、基本生物学特征与体内细胞相似 体外培养的细胞不仅存在细胞和基质的相互
关系， 而且细胞和细胞之间在形态和机能上还存在着相 互关系
2、差异性
细胞离体后，失去神经和体液调节以及细胞 间的相互影响，在体外培养条件下可能会出现分化现象减 弱，形态功能单一化，生存一定时间后衰退死亡，出现连 续生长的细胞系或恶性细胞系等。因此体外培养的细胞可 视为一种在特定条件下的细胞群体，它们既保持着与体内 细胞相同的基本机构和功精能品，课件也有不同于体内细胞的性状3。
支持物能影响贴附，底物表面不洁不利于贴附，底 物表面带有阳性电荷利于贴附，一些特殊物质如 LETS，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。
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（三）接触抑制和密度抑制
细胞在体外培养过程中，细胞数量不断增多，生长 空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片。细 胞相互接触后，如果培养的是正常细胞，由于细
胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接 触抑制
（二）培养细胞分化状态的改变
1、分化 在个体发育的过程中，细胞后代的形态和功能上发生稳定性
差异过程称为细胞分化。细胞经体外培养后，其原有的功 能可能会迅速改变或消失，但其分化能力并未完全丧失。 细胞是否分化，关键是在于是否存在使细胞分化的条件， 把表皮细胞放在企业界面上培养，可分化成含大量角蛋白 丝的胶质细胞，但这种能力会随着培养时间的延长逐渐丧 失。 2、去分化 去分化也叫脱分化是指各种分化细胞，逐渐失去各自的形态 与功能个性，表现出某种趋同性的过程。
养有很多优越性，但也有不足之处。
动物细胞培养已广泛应用于病毒学，免疫学， 遗传学，肿瘤学，细胞生物学，毒理学和临 床医学等各个领域。利用细胞培养技术已经 生产出了多种生物制品，如狂犬病疫苗，干
扰素，生长调节素。
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第一节体外培养动物细胞的生物学特征
一、体外培养物的细胞生物学特点
（一）生物学特征的两重性
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传代细胞由于目中因素的影响，可能发生自发转化，其标志 是细胞获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即 细胞获得永久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系。 细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。转化细胞除了比 正常细胞能分裂更多的代数之外，还具有不受细胞密度的 影响，不具有接触抑制现象和细胞形状不规则，出现异常 染色体的特性。转化后的细胞也可能具有恶性性质。
（二）培养细胞“一代”生存期
体外培养的细胞当生长达到一定密度后，都需要做传 代处理。 所谓细胞“一代”是指从细胞接种到分离在培 养时的一段时间。它与细胞世代和倍增不同，在细胞一代 中，细胞能倍增三至六次。每一代的细胞群体都会经历以 下四个阶段：1、潜伏期 2、对数生长期 3、稳定期 4、 衰亡期
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• 1、潜伏期：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中悬浮状态的悬浮期，
此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于第五表面上的 过程，称为贴壁，悬浮期结束。
• 细胞贴附于支持物后，要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处 于潜伏期可有运动行为，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期和细胞密度、 细胞种类和培养基性质等密切相关。初代细胞培养细胞潜伏期长，24至96h 或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24h；细胞接种密度大时潜 伏期短。
2、悬浮性细胞
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悬浮性细胞
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（二）细胞帖壁过程
对于贴壁型细胞，在液体环境中生长时，基本呈圆 形，当附于支持物表面后，开始仍为圆形，但很 快会发生形态上的改变，转变为圆饼形即放射延 展细胞。在1/2至2小时后，过渡为极性细胞，可 呈纺锤形，三角形或不规则多角形等各种形态。
• 2、对数生长期：当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入对
数生长期。这是细胞增长最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量可作为 判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数MI表示，即细 胞群中每1000个细胞中的分裂相数。
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二、体外培养细胞的形态
当细胞初一较好的培养条件时，形态上有相对的一致性。在 一定程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别，故 可作为细胞形态学的一个指标或依据。但它可受很多因素 的影响而发生改变。
（一）贴附型细胞和悬浮型细胞
1、贴附型细胞（见下图） 1） 成纤维细胞型 2 ）上皮细胞型 3 ）游走细胞型 4 ）多形细胞型
• 第一节 体外培养动物细胞的生物学特征
• 第二节 动物细胞体外培养技术
• 第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定
• 第四节 细胞同步化
• 第五节 器官培养
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动物细胞培养技术
动物细胞培养是用无菌操作的方法将动物体 内的组织或器官取出，模拟动物体内的生理 条件，在体外进行培养，并观察细胞的生长， 发育及衰老等生命现象的技术。动物细胞培
当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少， 代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的
影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。
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三、培养细胞的增殖能力
体内细胞生长处于动态平衡环境中，而体外培养细胞的 生存环境是培养瓶、培养皿或其他容器。生存空间和营养 是有限的。当增殖到一定密度时，则需分离出一部分细胞 并跟新营养液，否则将会影响细胞的继续生存，这一过程
称传代
（一）培养细胞生命期、
培养细胞生命期是指细胞在体外培养条件下持续增殖和 生长的时间。正常细胞在体外培养时，不论细胞的种类和 供体的年龄如何，在细胞生存全过程中，基本经历以下三
个阶段。
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1、原代培养基
原代培养基也称初代培养基，即从动物机体内取出组织接种培养到第一 次传代阶段，一般持续一到四周。此期的细胞移动活跃，可见细胞活 跃，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养的细胞于体内相应的细胞性 状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。
2、传代期
初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。此期最长，细胞增殖旺盛， 能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二 倍体细胞性质应在初代培养期或传代后早期冷冻。如不冷冻则要反复 传代。一般，传代十至五十次左右，细胞增殖逐渐减慢，甚至停止， 进入衰退期。
3、衰退期
衰退期的细胞虽然能存活，但增殖很慢并逐渐停止，进而发生衰退死亡
1、基本生物学特征与体内细胞相似 体外培养的细胞不仅存在细胞和基质的相互
关系， 而且细胞和细胞之间在形态和机能上还存在着相 互关系
2、差异性
细胞离体后，失去神经和体液调节以及细胞 间的相互影响，在体外培养条件下可能会出现分化现象减 弱，形态功能单一化，生存一定时间后衰退死亡，出现连 续生长的细胞系或恶性细胞系等。因此体外培养的细胞可 视为一种在特定条件下的细胞群体，它们既保持着与体内 细胞相同的基本机构和功精能品，课件也有不同于体内细胞的性状3。
支持物能影响贴附，底物表面不洁不利于贴附，底 物表面带有阳性电荷利于贴附，一些特殊物质如 LETS，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。
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（三）接触抑制和密度抑制
细胞在体外培养过程中，细胞数量不断增多，生长 空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片。细 胞相互接触后，如果培养的是正常细胞，由于细
胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接 触抑制
（二）培养细胞分化状态的改变
1、分化 在个体发育的过程中，细胞后代的形态和功能上发生稳定性
差异过程称为细胞分化。细胞经体外培养后，其原有的功 能可能会迅速改变或消失，但其分化能力并未完全丧失。 细胞是否分化，关键是在于是否存在使细胞分化的条件， 把表皮细胞放在企业界面上培养，可分化成含大量角蛋白 丝的胶质细胞，但这种能力会随着培养时间的延长逐渐丧 失。 2、去分化 去分化也叫脱分化是指各种分化细胞，逐渐失去各自的形态 与功能个性，表现出某种趋同性的过程。
养有很多优越性，但也有不足之处。
动物细胞培养已广泛应用于病毒学，免疫学， 遗传学，肿瘤学，细胞生物学，毒理学和临 床医学等各个领域。利用细胞培养技术已经 生产出了多种生物制品，如狂犬病疫苗，干
扰素，生长调节素。
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第一节体外培养动物细胞的生物学特征
一、体外培养物的细胞生物学特点
（一）生物学特征的两重性
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传代细胞由于目中因素的影响，可能发生自发转化，其标志 是细胞获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即 细胞获得永久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系。 细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。转化细胞除了比 正常细胞能分裂更多的代数之外，还具有不受细胞密度的 影响，不具有接触抑制现象和细胞形状不规则，出现异常 染色体的特性。转化后的细胞也可能具有恶性性质。
（二）培养细胞“一代”生存期
体外培养的细胞当生长达到一定密度后，都需要做传 代处理。 所谓细胞“一代”是指从细胞接种到分离在培 养时的一段时间。它与细胞世代和倍增不同，在细胞一代 中，细胞能倍增三至六次。每一代的细胞群体都会经历以 下四个阶段：1、潜伏期 2、对数生长期 3、稳定期 4、 衰亡期
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• 1、潜伏期：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中悬浮状态的悬浮期，
此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于第五表面上的 过程，称为贴壁，悬浮期结束。
• 细胞贴附于支持物后，要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处 于潜伏期可有运动行为，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期和细胞密度、 细胞种类和培养基性质等密切相关。初代细胞培养细胞潜伏期长，24至96h 或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24h；细胞接种密度大时潜 伏期短。
2、悬浮性细胞
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悬浮性细胞
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（二）细胞帖壁过程
对于贴壁型细胞，在液体环境中生长时，基本呈圆 形，当附于支持物表面后，开始仍为圆形，但很 快会发生形态上的改变，转变为圆饼形即放射延 展细胞。在1/2至2小时后，过渡为极性细胞，可 呈纺锤形，三角形或不规则多角形等各种形态。
• 2、对数生长期：当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入对
数生长期。这是细胞增长最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量可作为 判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数MI表示，即细 胞群中每1000个细胞中的分裂相数。
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二、体外培养细胞的形态
当细胞初一较好的培养条件时，形态上有相对的一致性。在 一定程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别，故 可作为细胞形态学的一个指标或依据。但它可受很多因素 的影响而发生改变。
（一）贴附型细胞和悬浮型细胞
1、贴附型细胞（见下图） 1） 成纤维细胞型 2 ）上皮细胞型 3 ）游走细胞型 4 ）多形细胞型