牛血清蛋白酶联免疫检测试剂盒的研制及验证_潘殊男
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DO I :10.13309/j .cnki .pmi .2008.02.005
20
微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 2期 ProginMicrobiolImmunolNov.2008, Vol.36 No.2
牛血清蛋白酶联免疫检测试剂盒的研制及验证
潘殊男 , 杨云凯 , 杨 冰 , 刘保奎 , 董小曼 (北京天坛生物制品股份有限公司 , 北京 100024)
麻疹疫苗 、腮腺炎疫苗 、麻疹 -腮腺炎 -风疹联合 疫苗及试验性水痘疫苗均为北京天坛生物制品股份
有限公司产品 。 2 方法 2.1 兔抗牛血清的制备
用 2kg体重健康雄性青紫蓝家兔 5只 , 每只家 兔后脚掌注射 100mg/ml的活卡介苗 0.3ml, 7d后 将福氏完全佐剂与牛血清按 1/1比例混合并匀浆乳 化后 , 于家兔后腿每侧肿大的腘窝淋巴结注射 0.5ml 进行基础免疫 。 1个月后 , 将福氏不完全佐剂与牛 血清按 1 /1比例混合并匀浆乳化后 , 每只家兔背部 皮下多点注射 0.5ml进行加强免疫 , 共加强 5针 , 每 次间隔 1个月 。 每次免疫后第 7d于耳静脉采血 , 并 用免疫双扩散法测定其抗体效价 , 双扩效价达 1∶16 的兔抗血清 , 颈动脉采血后以正辛酸 -硫酸铵沉淀法 提纯抗体 , 纯度应不低于 85%。 2.2 酶标抗体的制备
dataqualitymonitoringofresidualbovineserum albumininvaccinesofourcompany.
Keywords:Bovineserumprotein;Kit
目前 , 疫苗生产普遍采用牛血清作为细胞培养 的主要成分 , 但它相对于人体是一种异源蛋白 , 注射 后有可能引发过敏性休克等不良反应 , 目前已见报 道的过敏成分 主要是牛血 清白蛋白 (Bovineserum albumin, BSA)和牛血清 IgG(Bovineimmunoglobulin G, B-IgG), 为了有效控制过敏原含量 , 中国生物制 品规程 2000年版明确规定以反向间接血凝法检测 疫苗中 牛血清蛋白 (Bovineserum proteins, BSP)残 余量不得超过 50ng/ml为合格 〔1〕 , 但该方法是半定 量方法 , 干扰因素较多 。 2004年国内研制出酶联免 疫检测试剂盒 , 经验证具有较好的准确度 、敏感度和 重复性 , 操作方便快捷 , 但该方 法仅能测定 BSA含 量 , 经验证不能测定 B-IgG含 量 , 而疫苗 中残余 BIgG蛋白的吸附能力较强 , 虽经洗涤换液后仍偶有 残存 , 人群注射后可能 会增加过敏反 应的风险 〔2〕 ,
敏度 。配制 1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、 200ng/mlBSP含量的溶液 。按所 建立的试验方法 测定其吸收值 , 通过相关分析找出其最佳线性范围 以确定试剂盒最终可准确定量的标准品线性范围 。 配置试验线性范围内低浓度 (5、4、3、2、1ng/ml)的 BSP溶液 , 重 复测 定以确 定 该试 剂盒 的可 靠检 测 限量 。 2.5.2 准确度和精密度 配置试验线性范围内 高 (20ng/ml)、中 (10ng/ml)、低 (5ng/ml)3个 不同 浓度的 BSP溶液 , 同一实验内对每一份样品重复测 定 12次 , 计算测定的变异性 (标准差 /测定均值 ;试 验内精密度 )和准确度 (测定值 /理论值 );在不同 3 次试验中对上述浓度样品进行测定 , 计算测定的变 异性 (标准差 /测定均值 ;试验间精密度 )和准确度 (测定值 /理论值 )。 2.5.3 稳定性 为预测试剂盒的稳定性 , 进行 加速破坏试验 , 将试剂盒 37℃放置 3d, 与 4℃放置 的试剂盒同时测定 , 比较 A值 、相关系数 、内部质控 品的变化 。 2.5.4 特异性 鉴于该试剂盒主要用于疫苗中 牛血清的检测 , 因此特异性试验主要考察疫苗中存 在的其他成分可能对试验产生的干扰 。 将疫苗常用 的稳 定 剂 人 血 清白 蛋 白 (Humanserum albumin, HSA), 鸡胚细胞分泌的卵清蛋白 , 复合疫苗保护剂 I及 II分别作为待检样品进行测定 , 以 BSP, BSA, BIgG作为阳性对照 。 2.5.5 应 用于 检 测 不同 疫 苗 中 BSP的 适 用 性 同时 用 BSP-ELISA试剂盒与 WX-BSA-ELISA试剂 盒检测不同疫苗中残余蛋白含量 。比较检测结果的 差异及符合程度 。
摘 要 :为研制酶联免疫试剂盒以检测病毒性疫苗中 残余牛 血清蛋白 (BSP)含量 , 制备 高效价 高纯度 的兔抗 BSP
多克隆抗体作为包被 抗体和酶标抗体 , 建立了 ELISA双抗体夹 心法并 组建试 剂盒 , 通过标 准剂量 曲线可对 样品中
所含 BSP、BSA及 B-IgG进 行定量 , 经验证该方法标准曲线线性范围内 r≥0.98, 对 BSP的检测限 量为 3ng/ml;分别 检测 5、10、20ng/ml含量的 BSP时 , 试验内 (n=12)和试验间 (n=3)测定的变异系数在 3.71%到 7.29%之 间 , 回收 率在 93.4% ～ 106.3%, 未见该方法与人血清白蛋白 、卵清蛋白以及 疫苗复合保护剂之间有交叉反应 。 该法敏感度 高 , 准确性 、重复性和稳定性好 , 可用于疫苗牛血清残余蛋白的质量控制 。
vineIgGbythestandarddosecurve.Thedetectionquantawasaslowas3ng/mlandtheprecisionwaspreferablebecause thecoefficientsofvariationoftheresultsdetectingtheBSPstandardsof5, 10, 20ng/mlconcentrationswerefrom 3.71% to7.29%, andtherecoveryfrom 93.4% to106.3% indicatedmeasuringresultshadreturnaccuracy.Therewasnocross reactionobservedwhendetectinghumanserum albumin, ovalbuminandvaccineprotectins.Themethodcouldbeusedfor
收稿日期 :2007-12-12;修回日期 :2008- 03-12 作者简介 :潘殊男 (1974-)男 , 微生物学免疫学硕士研究生 , 助理研究
员 , 主要从事生物制品检测试剂盒的研发 。
因此尽管中国药典 2005版规定将酶联免疫试剂盒 检测疫苗 BSA残余量不超过 50ng/剂定为合格 〔3〕; 但用酶联免疫法检测疫苗中牛血清蛋白含量而非牛 血清白蛋白含量 , 理论上仍然是最客观反映疫苗中 牛血清过敏原蛋白残余量的检测方法 , 为了保证疫 苗中牛血清过敏原控制的可靠性 , 严格控制产品质 量 , 研制了可以较准确测定 BSA和 B-IgG的酶联免 疫检测试剂盒 。
采用改良过碘酸钠 氧化法 〔4〕以 辣根过氧化物 酶对纯化的兔抗血清进行标记 。 2.3 ELISA夹心法
将定量后的兔抗牛血清适量稀释后包被 96孔 酶标板 , 4℃包被过夜 , 37℃封闭 1h。 分别加入 0 ～ 40ng/ml浓度 BSP的标 准溶液 , 每浓度 重复 2 孔 , 100μl/孔 。 以稀释液作为空白对照 。 待测样品做 4 倍稀释后测定 。 37℃孵育 1.5h, PBS-Tween20洗涤 。 加入 1∶5000稀释的酶标 BSP抗体 , 100μl/孔 , 37℃ 30min。 PBS-Tween20 洗 涤 。 加 入 TMB 显 色 , 100μl/孔 , 室温 10min。 加入 2mol/LH2 SO4终 止 。 测定 A450 , 以 0ng/ml标准溶液的 A值消零 。以 BSP 含量为横坐标 , A值 (两孔均值 )为纵坐标 , 绘制标 准曲线 。应为一直线相关 。 2.4 试剂盒测定参数的确定
微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 2期 ProginMicrobiolImmunolNov.2008, Vol.36 No.2
Βιβλιοθήκη Baidu21
白为天坛生物制品股份有限公司质监部制备 ;WXBSA-ELISA检测试剂盒 (批号 20050301)购自无锡 博生生 物 技术 开 发 公司 ;B-IgG标 准品 购 自 美国 Cygnus公司 。 1.2 待检样品
关键词 :牛血清蛋白 ;试剂盒
中图分类号 :Q512
文献标识码 :A
文章编号 :1005-5673(2008)02-0020- 04
DevelopmentandvalidationofELISAkitondetectingresidualbovineserum proteinsinviralvaccines PANShu-
establishedandELISAkitwasdevelopedbycoatinghightiterantibodyintheplatepurifiedfromrabbitserumandlabelling
thesameantibodywithHRPasdetectionantibody, whichcandetectbovineserum proteins, bovineserumalbuminandbo-
材料与方法
1 材料 1.1 检测用试剂
96孔聚苯乙烯酶标板购自 Coastar公司 ;底物 液 A液为含过氧化脲的柠檬酸 -醋酸盐缓冲液 , 底物 液 B液为四甲基联苯胺 (TMB), 均由北京天坛生物 制品股份有限公司诊断用品室提供 ;国家牛血清标 准品 (批号 200501)购自中国药品生物制品检定所 ; 抗牛血清蛋白 、辣根过氧化物酶标记的抗牛血清蛋
nan, YANGYun-kai, YANGBing, etal.(BeijingTianTanBiologicalProductsCo., LTD, Beijing, 100024, China) Abstract:Tomeasurethecontentsofresidualbovineserumproteins(BSP)ondevelopingELISAkit.ELISAmethodwas
图 1 BSP检测的标准曲线 Fig.1 ThestandardcurveofBSP
表 1。而 3次不同试验对以上 3个浓度 BSP的测定 结果分别为 7.2% 、4.5%和 3.7%, 回收 率分别为
经多次试验 , 确定试剂盒相关参数需满足以下 条件 , 试 验 方 可 成 立 。 0ng/ml标 准 溶 液 A值 ≤ 0.15;25ng/ml标准溶液 A值 ≥0.7;内部参比品测 定浓度范围为 17 ～ 23ng/ml;标准曲线 r≥0.98。 2.5 ELISA夹心方法的验证 2.5.1 最佳线性范围及定量限量验证 通过直 线性和定量限量的测定 , 确定方法的测定范围及灵
对 5、10和 30ng/ml浓度的 BSP样品 , 同一试验 内测 定结 果 的 变 异 系 数分 别 为 5.3%、 5.4%和 6.3%, 回收率分别为 93.4%、99.9%和 96.2%, 见
22
微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 2期 ProginMicrobiolImmunolNov.2008, Vol.36 No.2
结果
1 标准曲线 对 0 ～ 200ng/ml的 BSP标准溶液及其测定的吸
收值进行相关性分析 , 结果在 0 ～ 25ng/ml之间有较 好的线性 , r值在 0.98 以上 , 定 量最可靠 , 见图 1。 因此确定该试剂盒的线性定量范围 。根据标准曲线 以及试验中 被测定 样本的 吸收 值 , 可求 出样本 中 BSP含量 。试验定 量限量为 3ng/ml。 对于 BSP含 量高于 25ng/ml的样品可进行稀释来精确定量 。 2 准确度和精密度
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微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 2期 ProginMicrobiolImmunolNov.2008, Vol.36 No.2
牛血清蛋白酶联免疫检测试剂盒的研制及验证
潘殊男 , 杨云凯 , 杨 冰 , 刘保奎 , 董小曼 (北京天坛生物制品股份有限公司 , 北京 100024)
麻疹疫苗 、腮腺炎疫苗 、麻疹 -腮腺炎 -风疹联合 疫苗及试验性水痘疫苗均为北京天坛生物制品股份
有限公司产品 。 2 方法 2.1 兔抗牛血清的制备
用 2kg体重健康雄性青紫蓝家兔 5只 , 每只家 兔后脚掌注射 100mg/ml的活卡介苗 0.3ml, 7d后 将福氏完全佐剂与牛血清按 1/1比例混合并匀浆乳 化后 , 于家兔后腿每侧肿大的腘窝淋巴结注射 0.5ml 进行基础免疫 。 1个月后 , 将福氏不完全佐剂与牛 血清按 1 /1比例混合并匀浆乳化后 , 每只家兔背部 皮下多点注射 0.5ml进行加强免疫 , 共加强 5针 , 每 次间隔 1个月 。 每次免疫后第 7d于耳静脉采血 , 并 用免疫双扩散法测定其抗体效价 , 双扩效价达 1∶16 的兔抗血清 , 颈动脉采血后以正辛酸 -硫酸铵沉淀法 提纯抗体 , 纯度应不低于 85%。 2.2 酶标抗体的制备
dataqualitymonitoringofresidualbovineserum albumininvaccinesofourcompany.
Keywords:Bovineserumprotein;Kit
目前 , 疫苗生产普遍采用牛血清作为细胞培养 的主要成分 , 但它相对于人体是一种异源蛋白 , 注射 后有可能引发过敏性休克等不良反应 , 目前已见报 道的过敏成分 主要是牛血 清白蛋白 (Bovineserum albumin, BSA)和牛血清 IgG(Bovineimmunoglobulin G, B-IgG), 为了有效控制过敏原含量 , 中国生物制 品规程 2000年版明确规定以反向间接血凝法检测 疫苗中 牛血清蛋白 (Bovineserum proteins, BSP)残 余量不得超过 50ng/ml为合格 〔1〕 , 但该方法是半定 量方法 , 干扰因素较多 。 2004年国内研制出酶联免 疫检测试剂盒 , 经验证具有较好的准确度 、敏感度和 重复性 , 操作方便快捷 , 但该方 法仅能测定 BSA含 量 , 经验证不能测定 B-IgG含 量 , 而疫苗 中残余 BIgG蛋白的吸附能力较强 , 虽经洗涤换液后仍偶有 残存 , 人群注射后可能 会增加过敏反 应的风险 〔2〕 ,
敏度 。配制 1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、 200ng/mlBSP含量的溶液 。按所 建立的试验方法 测定其吸收值 , 通过相关分析找出其最佳线性范围 以确定试剂盒最终可准确定量的标准品线性范围 。 配置试验线性范围内低浓度 (5、4、3、2、1ng/ml)的 BSP溶液 , 重 复测 定以确 定 该试 剂盒 的可 靠检 测 限量 。 2.5.2 准确度和精密度 配置试验线性范围内 高 (20ng/ml)、中 (10ng/ml)、低 (5ng/ml)3个 不同 浓度的 BSP溶液 , 同一实验内对每一份样品重复测 定 12次 , 计算测定的变异性 (标准差 /测定均值 ;试 验内精密度 )和准确度 (测定值 /理论值 );在不同 3 次试验中对上述浓度样品进行测定 , 计算测定的变 异性 (标准差 /测定均值 ;试验间精密度 )和准确度 (测定值 /理论值 )。 2.5.3 稳定性 为预测试剂盒的稳定性 , 进行 加速破坏试验 , 将试剂盒 37℃放置 3d, 与 4℃放置 的试剂盒同时测定 , 比较 A值 、相关系数 、内部质控 品的变化 。 2.5.4 特异性 鉴于该试剂盒主要用于疫苗中 牛血清的检测 , 因此特异性试验主要考察疫苗中存 在的其他成分可能对试验产生的干扰 。 将疫苗常用 的稳 定 剂 人 血 清白 蛋 白 (Humanserum albumin, HSA), 鸡胚细胞分泌的卵清蛋白 , 复合疫苗保护剂 I及 II分别作为待检样品进行测定 , 以 BSP, BSA, BIgG作为阳性对照 。 2.5.5 应 用于 检 测 不同 疫 苗 中 BSP的 适 用 性 同时 用 BSP-ELISA试剂盒与 WX-BSA-ELISA试剂 盒检测不同疫苗中残余蛋白含量 。比较检测结果的 差异及符合程度 。
摘 要 :为研制酶联免疫试剂盒以检测病毒性疫苗中 残余牛 血清蛋白 (BSP)含量 , 制备 高效价 高纯度 的兔抗 BSP
多克隆抗体作为包被 抗体和酶标抗体 , 建立了 ELISA双抗体夹 心法并 组建试 剂盒 , 通过标 准剂量 曲线可对 样品中
所含 BSP、BSA及 B-IgG进 行定量 , 经验证该方法标准曲线线性范围内 r≥0.98, 对 BSP的检测限 量为 3ng/ml;分别 检测 5、10、20ng/ml含量的 BSP时 , 试验内 (n=12)和试验间 (n=3)测定的变异系数在 3.71%到 7.29%之 间 , 回收 率在 93.4% ～ 106.3%, 未见该方法与人血清白蛋白 、卵清蛋白以及 疫苗复合保护剂之间有交叉反应 。 该法敏感度 高 , 准确性 、重复性和稳定性好 , 可用于疫苗牛血清残余蛋白的质量控制 。
vineIgGbythestandarddosecurve.Thedetectionquantawasaslowas3ng/mlandtheprecisionwaspreferablebecause thecoefficientsofvariationoftheresultsdetectingtheBSPstandardsof5, 10, 20ng/mlconcentrationswerefrom 3.71% to7.29%, andtherecoveryfrom 93.4% to106.3% indicatedmeasuringresultshadreturnaccuracy.Therewasnocross reactionobservedwhendetectinghumanserum albumin, ovalbuminandvaccineprotectins.Themethodcouldbeusedfor
收稿日期 :2007-12-12;修回日期 :2008- 03-12 作者简介 :潘殊男 (1974-)男 , 微生物学免疫学硕士研究生 , 助理研究
员 , 主要从事生物制品检测试剂盒的研发 。
因此尽管中国药典 2005版规定将酶联免疫试剂盒 检测疫苗 BSA残余量不超过 50ng/剂定为合格 〔3〕; 但用酶联免疫法检测疫苗中牛血清蛋白含量而非牛 血清白蛋白含量 , 理论上仍然是最客观反映疫苗中 牛血清过敏原蛋白残余量的检测方法 , 为了保证疫 苗中牛血清过敏原控制的可靠性 , 严格控制产品质 量 , 研制了可以较准确测定 BSA和 B-IgG的酶联免 疫检测试剂盒 。
采用改良过碘酸钠 氧化法 〔4〕以 辣根过氧化物 酶对纯化的兔抗血清进行标记 。 2.3 ELISA夹心法
将定量后的兔抗牛血清适量稀释后包被 96孔 酶标板 , 4℃包被过夜 , 37℃封闭 1h。 分别加入 0 ～ 40ng/ml浓度 BSP的标 准溶液 , 每浓度 重复 2 孔 , 100μl/孔 。 以稀释液作为空白对照 。 待测样品做 4 倍稀释后测定 。 37℃孵育 1.5h, PBS-Tween20洗涤 。 加入 1∶5000稀释的酶标 BSP抗体 , 100μl/孔 , 37℃ 30min。 PBS-Tween20 洗 涤 。 加 入 TMB 显 色 , 100μl/孔 , 室温 10min。 加入 2mol/LH2 SO4终 止 。 测定 A450 , 以 0ng/ml标准溶液的 A值消零 。以 BSP 含量为横坐标 , A值 (两孔均值 )为纵坐标 , 绘制标 准曲线 。应为一直线相关 。 2.4 试剂盒测定参数的确定
微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 2期 ProginMicrobiolImmunolNov.2008, Vol.36 No.2
Βιβλιοθήκη Baidu21
白为天坛生物制品股份有限公司质监部制备 ;WXBSA-ELISA检测试剂盒 (批号 20050301)购自无锡 博生生 物 技术 开 发 公司 ;B-IgG标 准品 购 自 美国 Cygnus公司 。 1.2 待检样品
关键词 :牛血清蛋白 ;试剂盒
中图分类号 :Q512
文献标识码 :A
文章编号 :1005-5673(2008)02-0020- 04
DevelopmentandvalidationofELISAkitondetectingresidualbovineserum proteinsinviralvaccines PANShu-
establishedandELISAkitwasdevelopedbycoatinghightiterantibodyintheplatepurifiedfromrabbitserumandlabelling
thesameantibodywithHRPasdetectionantibody, whichcandetectbovineserum proteins, bovineserumalbuminandbo-
材料与方法
1 材料 1.1 检测用试剂
96孔聚苯乙烯酶标板购自 Coastar公司 ;底物 液 A液为含过氧化脲的柠檬酸 -醋酸盐缓冲液 , 底物 液 B液为四甲基联苯胺 (TMB), 均由北京天坛生物 制品股份有限公司诊断用品室提供 ;国家牛血清标 准品 (批号 200501)购自中国药品生物制品检定所 ; 抗牛血清蛋白 、辣根过氧化物酶标记的抗牛血清蛋
nan, YANGYun-kai, YANGBing, etal.(BeijingTianTanBiologicalProductsCo., LTD, Beijing, 100024, China) Abstract:Tomeasurethecontentsofresidualbovineserumproteins(BSP)ondevelopingELISAkit.ELISAmethodwas
图 1 BSP检测的标准曲线 Fig.1 ThestandardcurveofBSP
表 1。而 3次不同试验对以上 3个浓度 BSP的测定 结果分别为 7.2% 、4.5%和 3.7%, 回收 率分别为
经多次试验 , 确定试剂盒相关参数需满足以下 条件 , 试 验 方 可 成 立 。 0ng/ml标 准 溶 液 A值 ≤ 0.15;25ng/ml标准溶液 A值 ≥0.7;内部参比品测 定浓度范围为 17 ～ 23ng/ml;标准曲线 r≥0.98。 2.5 ELISA夹心方法的验证 2.5.1 最佳线性范围及定量限量验证 通过直 线性和定量限量的测定 , 确定方法的测定范围及灵
对 5、10和 30ng/ml浓度的 BSP样品 , 同一试验 内测 定结 果 的 变 异 系 数分 别 为 5.3%、 5.4%和 6.3%, 回收率分别为 93.4%、99.9%和 96.2%, 见
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微生物学免疫学进展 2008年第 36卷第 2期 ProginMicrobiolImmunolNov.2008, Vol.36 No.2
结果
1 标准曲线 对 0 ～ 200ng/ml的 BSP标准溶液及其测定的吸
收值进行相关性分析 , 结果在 0 ～ 25ng/ml之间有较 好的线性 , r值在 0.98 以上 , 定 量最可靠 , 见图 1。 因此确定该试剂盒的线性定量范围 。根据标准曲线 以及试验中 被测定 样本的 吸收 值 , 可求 出样本 中 BSP含量 。试验定 量限量为 3ng/ml。 对于 BSP含 量高于 25ng/ml的样品可进行稀释来精确定量 。 2 准确度和精密度