动物转基因技术研究进展

动物转基因技术研究进展

姓名：赵亚光学号：11110910041

专业：生物科学班级：2011级二班

摘要：文章综述了目前使用的各种转基因动物技术——显微注射法、逆转录病毒法、核移植法、精子载体法、电击法、胚胎干细胞介导法和基因打靶技术,并简述了各种方法的优缺点。同时对转基因动物在提高生产性能、异种器官移植、基因治疗和生物反应器等方面的研究现状做了较系统的概述。并指出了目前存在的问题,对其前景进行了展望。

关键词：转基因动物;动物转基因技术；研究进展

动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达，以获得人们所期望得到的产物（优良品种的动物、活性产物等）。自1982，Palmiter等把大鼠生长激素基因导入小鼠一个去核的未受精的成熟卵母细胞中融合并激活，然后将重组胚直接或进行体外培养发育到桑葚胚或囊胚后植入同步化的假孕动物的子宫中而获得超级巨鼠以来 ,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣 ,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。

1 动物转基因技术

转基因技术就是将外源基因或体外重组的基因转移到动物的受精卵内,使其在动物体内得到整合和表达 , 以产生具有新遗传特征或性状的转基因动物 ,并能将新的遗传信息稳定地遗传给后代 ,获得转基因系或转基因群体 ,或者是将外源基因在特定调控元件作用下在某些宿主组织中进行独立的复制 ,并在一定的时间内表达外源蛋白。前一种情况是一种永久表达 ,又称为整合表达 ,这种表达具有遗传性 ,对改变动物的性状具有重大意义;后一种情况是一种暂时性表达 ,不能遗传给后代 ,只在当代表达 ,这种表达为人和动物疾病进行基因治疗和基因预防奠定了理论基础。其中外源基因导入细胞的方法有：

1.1 显微注射法

这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的动物转基因技术。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵的雄性原核中,利用受精卵繁殖过程中雌雄原核的融合和DNA的复制,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。1980年Gordon 将SV40的TK基因整合后的质粒以显微注射法注入小鼠受精卵原核中,首次成功地培育出转基因小鼠。随后利用该方法,转基因兔、猪、绵羊、鱼、牛和山羊也都相继获得成功,该方法的优点是基因导入可靠;缺点是成功率低。

1.2 扎刺法

扎刺法是先将胚胎放在含有目的基因的培养液里,然后用细针扎到细胞或细胞核里,针快速拔出,此时外源基因就进入细胞核,细胞膜结构的流动性随之而关闭,胚胎内进入的溶液很少。这种方法比显微注射快,对胚胎损害小,但转基因频率低。

1.3 核移植法

该方法首先将外源基因导入到供体细胞中,选择其中带有外源基因的细胞进行扩增,然后将这种细胞的细胞核导入一个去了核的未受精的成熟卵母细胞中融合并激活将重组胚胎直接或进行体外培养发育到桑葚胚或囊胚后植入同步化的假孕动物的输卵管。1997年世界上第一头体细胞克隆羊“多莉”(DOLIY)在英国罗斯林研究所诞生,就应用了该法。安晓荣等通过体细胞核移植技术制作了转基因绵羊。

1.4 逆转录病毒载体导入法

将目的基因重组到逆转录病毒载体上,包装成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的,通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去,使这种细胞具有新的遗传性。Haskell 等应用该方法制作了转基因牛。1974年Janenisch等将SV40DNA注入小鼠囊胚腔中获得转基因小鼠。此方法的优点在于:宿主范围广泛,基因整合率高。对于显微注射比较困难的禽类早期胚胎而言,是一种非常适用的方法,可以直接将载体病毒注射到未经孵化的鸡受精卵的卵黄中。其缺点是:载体病毒不能再结合用以产生新的有感染的病毒,包裹的核酸大小有限制,

不需要长末端重复子(LTRs)干扰可进行组织特异性表达,获得有感染多种宿主细胞的病毒。

1.5 电击法

电击法也叫电场转移基因法,其原理是外界的高电压脉冲可以改变细胞膜的结构,使膜产生可变性的电穿孔,从而使得一定大小的DNA分子通过细胞膜进入细胞核,并进一步整合到宿主DNA上。1992年,Lnoue等利用该方法在鱼类的转基因研究中获得成功。

1.6 性腺转基因方法

早期的动物转基因研究中,大量应用了利用逆转录病毒介导、显微注射、电穿孔、脂质体

介导、精子载体法等方法,这些方法需要复杂的操作仪器和胚胎体外培养等复杂的实验过程, 同时获得转基因动物的效率很低,一般不到10%。K i m e t a l根据精子作为外源基因载体转基因的原理,及一般细胞都能够吸收外源DNA的原理,把外源基因用脂质体转染精原细胞,再将被转染的精原细胞微注射到精原细胞被破坏的雄性动物的睾丸的曲精细管内,结果发现小鼠在康复后可以产生携带外源基因的精子。如果利用这样的小鼠对雌鼠交配，可以预期能够产生含有所转外源基因的转基因小鼠。沈新明等省略了对精原细胞转染外源基因并对曲精细胞移植转染细胞的步骤,直接用人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白表达载体注射到小鼠的曲精细管内,最后通过与雌鼠交配,成功获得了表达绿色荧光蛋白的转基因仔鼠。Yuanetal报道通过向曲精细管内注射外源D N A,然后再结合对曲精细管电击或电穿孔处理,以使外源基因进入睾丸生精细胞。然后将这些处理的雄鼠与母鼠交配, 得到的小鼠中有一组的阳性检测率达25%。Sheneal.则将处理方法更为简化, 首先直接向雄兔睾丸内注射携带绿色荧光表达的外源DNA 及二甲基亚砜的介质，使DNA能够进入睾丸细胞和生精细胞。一个月后用处理的雄兔与雌兔交配，所产生后代的56%仔兔能高效地表达所导入的外源基因。这一转入外源基因的阳性率大大高于以往精子载体法或其他非定点转基因方法的结果。对应于在雄性动物的向睾丸注射外源基因,Yangetal.直接对小鼠的卵巢注射绿色荧光蛋白基因,也可以得到转基因小鼠, 并且检测后代的阳性率达54%, 并且发现获得的6 代以内的转基因小鼠都具有较好的遗传稳定性。用同样的方法制作转基因鸡的研究中,阳性率高达67.65%。由于通过性腺转基因操作简便、技术要求较低、难度较小,这种方法将成为一个制作转基因动物的方向,有可能用于如猪和牛这样的大动物的转基因。然而该方法制备转基因动物时,仍然存在外源基因随机整合进入与宿主基因组的问题,因此目前还无法利用此方法随意地获得理想的转基因动物。

1.7 定点制作转基因动物的方法

由于非定点转基因方法使外源基因随机整合到宿主细胞染色体上, 使得制作转基因动物带有很大的偶然性,外源基因的表达的可控性也较差。同时由于外源基因随机整合到宿主基因组,很可能破坏宿主基因的正常表达,将影响到宿主的发育和存活。因此新的定点整合转基因方法就应运而生了,一般通称为基因打靶( gene targeting) 。

基因打靶是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的可对基因组进行定点修饰的实验技术。基因打靶通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组、精细地定点修饰和改造基因D N A片段,具有位点专一性强和打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传的特点。Thomas and Capecch首先对小鼠ES细胞进行了基因打靶, 然后将此打靶的ES 细胞移植进入小鼠囊胚,将此重组胚胎移植进入代孕母鼠, 最后产出嵌合体仔鼠,通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。基因打靶包括基因敲除( knock out) 和基因敲入( knock in) 技术。目前利用以上技术已经制备了大量基因敲除小鼠,在研究基因功能和疾病模型研究方面做出了贡献。相应地,外源基因也可以通过基因打靶转入小鼠基因组,并获得了通过基因敲入的转基因小鼠,实现了外源基因在宿主基因组的定点整合。

1.8 其它

除上述几种转基因方法外 ,为了某种特殊需要也探索一些其他方法 ,如激光导入法、受体介导的基因转移法、脂质体介导法、基因枪法等 ,但总体看来仍不十分理想 ,效率不高。

2转基因动物技术的应用现状

转基因动物是指通过转基因技术将外源基因导入动物生殖细胞,由此稳定整合到动物基因组,并能遗传给后代的动物。目前,转基因动物的研究主要包括三个方面:(1)利用转基因技术进行动物生产改良,培育新品种和提高生产性能,进行基因治疗。(2)利用转基因动物制造具有生物活性的产物,包括器官移植和生物反应器。(3)利用转基因动物确定研究手段,包括建立疾病模型和发育调控。

2.1 促进动物生长

常规育种改良畜禽品种进展较慢,而且有些种畜的生产性能已达到相当高的水平,很难获得较大的进展,利用转基因技术,将所需的优良基因直接转入待改良群体中,从而培育出具有优良品质的转基因品系。生长激素(GH)基因是转基因研究中运用最早的基因,1985年