流式细胞仪的原理

DNA 细 胞 周 期 分 析
G1
M (mitosis)
S (DNA synthesis)
G2
PI染色检测细胞周期 Protocol
离心收集细胞，弃上清，用PBS洗细胞两次。 加入预冷的70%乙醇，于40C固定过夜，或-200C长期
固定。 细胞染色：离心收集细胞，用1mlPBS洗细胞一次，
· ……
一、流式细胞仪的工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色 性与激发效率；
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术， 保证检测的灵敏度和特异性；
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的 多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速 度与统计分析精确性。
1.流式细胞仪的基本结构
双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点 密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利 用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒 数量的多少。
双参数直方图点图
度红 色 荧 光 强
绿色荧光强 度
（三）设 门 分 析 技 术 1.Gate设置：指根据该图的细胞群分布 选定其中想要分析的特定细胞群。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多 边形门、任意形状门和十字门。
通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对 具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进 行的。
细胞分选示意图
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴
不充电 弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
五、数 据 的 显 示 与 分 析
参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点
（2）测量快速、大量、准确、灵敏、定 量
流式细胞仪的检测范围
细胞结构
细胞功能
• 细胞大小 • 细胞颗粒度
· 细胞表面/胞浆/核的 特异性抗原
· 细胞活性
• DNA含量与细胞周期 · 细胞内/外的细胞因子
• RNA含量
· 激素结合位点
• 蛋白质含量 • ……
· 细胞受体 · 钙离子浓度 · 线粒体膜电位
加入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙锭（PI）， 100ug/mlRNase A,0.2% Triton X-100)40C避光孵 育30分钟。 流式细胞仪检测：一般细胞计数2-3万个。结果用软件 Modfit分析。
细胞凋亡的检测
细胞形态及细胞膜通透性的变化(Hoechest
33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）
通常在FCM应用中，选取FS作阈值，来排除样品中的 各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
前向散射光
侧 向 散 射 光（SS）
侧向散射光（side scatter, SS）：激 光束照射细胞时，光以90°角散射的讯 号，用于检测细胞内部结构属性。
胞仪分析。
Annexin-V和PI双染的特点和注意事项
检测特点：简便，快速，准确区分活细胞、凋 亡细胞和坏死细胞。
注意事项： 1.细胞制备（如贴壁细胞）和储存时细胞膜的破
损会导致磷脂酰丝氨酸(PS)跨膜分布的改变， 造成假阳性。 2.染色后立即上机检测。
Q3: 正常细胞； Q4：早期凋亡细胞； Q2：晚期凋亡细胞； Q1：坏死细胞。
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光信号的检测
使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量
荧光补偿
5 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
四、细 胞 分 选 原 理
统计 结果
计算机
多参数，高通量综合 分析
人工 简单，单参数
二、散 射 光 的 测 量
细胞在液柱中与激光束相交时向 周围360°立体角方向散射的光线信 号，它的强弱与细胞的大小、形状、 胞内颗粒折射等有关，主要分为前向 散射光和侧向散射光。
前 向 散 射 光（FS）
前向散射光（forward scatter, FS）： 激光束照射细胞时，光以相对轴较小角 度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检 测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与 细胞体积大小成正比。
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
（1）液 流 系 统
单细胞悬液
大多数仪器检测范围是在50-300 µm 大小。
将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程, 称为流体动力学聚焦
液流系统示意图
（2）光 学 系 统
由激光光源、分色反光镜、光束成形器、 透镜组、滤片和光电倍增管组成。
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均为 任意门
线性门
2. 区阈（Region设置）:
如十字门分析时，由四个 区阈构成，即 G=D1+D2+D3+D4。
D1：CD4+/CD3D2：CD4+/CD3+ D3：CD4- /CD3D4：CD4- /CD3+
六、流式细胞术的临床应用
（1）淋巴细胞亚群检测： CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19 免疫功能的变化监测，AIDS
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
侧向散射光
光散射测量的用途
测得的FS与SS信号通过计 算机处理，可得到FS-SS图， 由此可仅用散射光信号对未 染色的活细胞进行分析或分 选。
此为血细胞分类的基本 原理，但不能分析表面分子。
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
（2）HLA-B27:强直性脊柱炎 （3） 白血病免疫分型：白血病的分类 （4） 贫血的鉴定：PNH（CD55,CD59）,血小板抗体
(5) ………..
七、流 式 细 胞 仪 的 科 研 应 用
细胞周期的分析 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究 流式细胞术在免疫检验中的应用
对比-----流式细胞仪是一种特殊的显微镜
三、荧 光 的 测 量
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料 受激发后产Baidu Nhomakorabea，发射的荧光波长与激发光波长 不同。
每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色， 通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散 射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增 管。
选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞 上的多个不同特征。
图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散 点图 ） 设门分析技术
（一）参 数 说 明
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少以及荧光种类
（二）数 据 显 示 方 式
直分析方图
单参数直方图 双参数直方图:点图
二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析
Caspases激活(Caspase-3 ) 线粒体跨膜电位降低 (Rhodamine123） 膜磷脂酰丝氨酸外化(Annexin V-FITC/PI) Ca2+ 浓度升高 (Fluo-3） DNA断裂及含量的变化 (TUNEL 和 PI）
Annexin-V 和 PI 双 染 protocol
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室
光学信号 PMT、放大电路
光学显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大
1.单 参 数 直 方 图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
单参数直方图
量细 胞 相 对 数
信道 (channel )
2.双 参 数 直 方 图
双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细 胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确 定细胞在图上的表达位置。
细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液 （binding buffer）中以1 x 106 细胞/mL的 浓度重悬
吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。 加进适量的荧光标记的annexin-V试剂和PI。 混匀后避光室温下孵育15分钟。（必须在室温
下进行） 孵育后加进400ul染色缓冲液，立即上流式细
流式细胞术的原理及应用
无锡二院检验科
流式细胞术的基本概念
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以 流式细胞仪为检测手段，能够快速、精确 的对单个细胞或颗粒的物理和化学特性 （如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、 抗原等）进行多参数定量分析和分选的技 术。
流式细胞术的特点
（1）流式细胞术最大的特点是能在保持 细胞及细胞器的结构及功能不被破坏的 状态下，从分子水平上获取多种信号对 细胞进行定量分析或纯化分选。