从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术

从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术
2010-03-01 点击数：327
华南理工大学食品学院郑建仙
鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3.5％，是提取溶菌酶的方便来源。

但不同产地的鸡蛋，其蛋清中溶菌酶的含量有所不同。

工业上多采用直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、超滤和亲和色谱联合使用法等方法生产溶菌酶。

●直接结晶法
在鸡蛋清中加入5%的NaCl，调节pH到10左右，加入溶菌酶晶种，在0℃—5℃静置结晶，分离蛋清，得到结晶物，经纯化后再进行重结晶。

●离子交换法
溶菌酶是一种阳离子型蛋白质。

它由阴离子交换树脂吸附，使其从蛋清中分离出来，然后用
0.3mol/L以上食盐水洗脱树脂，洗脱液经透析、超滤、冷冻干燥便得粉状产品。

●亲和色谱法
利用酶与底物专一性结合形成复合物的特点，以羧甲基甲壳素（CM-CH）为底物专一性结合溶菌酶，然后用水和稀醋酸洗脱，洗脱液经透析、超滤、喷雾干燥或真空干燥便得粉状产品。

利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌酶制备研究的一个热点。

Stermberg等1974年报道了应用聚丙烯酸（PAA）形成PAA-溶菌酶聚电解质复合物。

Chern等于1996年应用pH敏感的亚微粒丙烯酸胶浆以及Eudragit L100作为溶菌酶的沉淀剂。

最近Vaigya等报道采用N-异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶，得到90％的收率。

他们认为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用pH敏感聚合物具有更多的优点，因为后者通常只有较低的得率。

●其他方法
用水或稀酸将鸡蛋清稀释2.5—10倍，调整液体pH至2.5—7.0，在此弱酸性水溶液中加入少量钙并加热，使溶菌酶以外的蛋白质大部分凝固，从分离出的上清液和凝固物的洗净液中提取溶菌酶。

Owen等1997年报道，使用连续逆流、膨胀床吸附系统分离溶菌酶，该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题，诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。

Ghosh等报道，采用小型的中空纤维超率系统从蛋清干粉中分离溶菌酶。

溶菌酶被选择性透过膜，而其他大分子的蛋清蛋白质被膜所截留。

改进系统的流体动力学导致溶菌酶透过的增加，从而获得较好的收率。

从蛋清中提取溶菌酶，如工艺路线图所示，取新鲜或冷冻鸡蛋清（已自然融化），检查其pH在8.0左右，过筛除杂后冷至5℃，加入724树脂在0℃—5℃条件下搅拌吸附6h左右，然后在0℃—5℃静置20h以上。

待分层后弃去上层清液，下层树脂用清水反复洗几次以除去杂蛋白，最后滤干。

在上述树脂中加入等体积pH6.5、0.15mol/L磷酸钠缓冲液，搅拌洗脱20min，过滤去除洗脱液（含杂物），再按同法处理2次。

将除杂后的树脂加入等量的10%硫酸铵溶液中搅拌洗脱30min，滤出洗脱液。

重复洗脱树脂3次，各次洗脱液混合在一起。

按洗脱液体积加入32%的固体硫酸铵粉末，搅拌溶解后于4℃—10℃滤过液，离心分出沉淀物。

将沉淀物用蒸馏水全部溶解，装入透析袋中在10℃水中透析滤过液以除去硫酸铵，收集透析液。

用4%的NaOH溶液调节pH至8.5—9.0，如有白色沉淀立即离心除去，然后用盐酸调节pH至3.5，再按体积加入5%的固体NaCl搅拌均匀，置冷处48h左右后经离心收集溶菌酶盐析物，经干燥即得溶菌酶产品。

从蛋壳中提取溶菌酶的工艺流程如图所示，取新鲜或冰冻蛋壳，用水冲洗干净后粉碎，按蛋壳量加入3/4量的1%NaCl溶液，搅拌均匀后用盐酸调节pH至6.0，继续搅拌，加热到40℃左右保持30—40min，随时调节pH至6.0。

抽提完毕后过滤收集滤液，滤渣加1/2量的1%NaCl溶液再抽提一次。

合并2次滤液，滤渣可放入下批再抽提。

所得提取液用20%—30%醋酸调节pH至4.6，在沸水中迅速加热到75℃—80℃，促使卵蛋白在等电点沉淀，速冷至室温后保持10h让沉淀物析出，然后过滤除去杂蛋白，收集滤液。

将滤液用20%NaOH溶液调节pH至6.0左右，搅拌下滴加10%聚丙烯酸（用量为滤液的1/4）。

产生凝聚物后溶液的pH为3.0左右。

静置15—30min
使凝聚物粘附于容器底部，倾去上层清液。

往凝聚物中加入少量蒸馏水，搅拌下滴加少量Na2CO3溶液使凝聚物溶解并调节pH是4.0左右，然后滴加50%CaCl2溶液使溶菌酶离解。

过滤分离出沉淀，收集滤液沉淀物可用H2SO4处理除去CaSO4以回收丙烯酸。

然后在上述滤液中滴加20%NaOH 溶液至pH9.5，静置46h，过滤分出清液，再加NaCl至浓度达5%，静置34h后产生粗结晶。

将粗结晶用pH4.6的醋酸溶解，过滤后分出不溶物，静置再结晶，干燥即得产品。

每千克壳膜可得重结晶溶菌酶1克左右。

从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术
2010-03-01 点击数：327
华南理工大学食品学院郑建仙
鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3.5％，是提取溶菌酶的方便来源。

但不同产地的鸡蛋，其蛋清中溶菌酶的含量有所不同。

工业上多采用直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、超滤和亲和色谱联合使用法等方法生产溶菌酶。

●直接结晶法
在鸡蛋清中加入5%的NaCl，调节pH到10左右，加入溶菌酶晶种，在0℃—5℃静置结晶，分离蛋清，得到结晶物，经纯化后再进行重结晶。

●离子交换法
溶菌酶是一种阳离子型蛋白质。

它由阴离子交换树脂吸附，使其从蛋清中分离出来，然后用
0.3mol/L以上食盐水洗脱树脂，洗脱液经透析、超滤、冷冻干燥便得粉状产品。

●亲和色谱法
利用酶与底物专一性结合形成复合物的特点，以羧甲基甲壳素（CM-CH）为底物专一性结合溶菌酶，然后用水和稀醋酸洗脱，洗脱液经透析、超滤、喷雾干燥或真空干燥便得粉状产品。

利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌酶制备研究的一个热点。

Stermberg等1974年报道了应用聚丙烯酸（PAA）形成PAA-溶菌酶聚电解质复合物。

Chern等于1996年应用pH敏感的亚微粒丙烯酸胶浆以及Eudragit L100作为溶菌酶的沉淀剂。

最近Vaigya等报道采用N-异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶，得到90％的收率。

他们认为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用pH敏感聚合物具有更多的优点，因为后者通常只有较低的得率。

●其他方法
用水或稀酸将鸡蛋清稀释2.5—10倍，调整液体pH至2.5—7.0，在此弱酸性水溶液中加入少量钙并加热，使溶菌酶以外的蛋白质大部分凝固，从分离出的上清液和凝固物的洗净液中提取溶菌酶。

Owen等1997年报道，使用连续逆流、膨胀床吸附系统分离溶菌酶，该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题，诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。

Ghosh等报道，采用小型的中空纤维超率系统从蛋清干粉中分离溶菌酶。

溶菌酶被选择性透过膜，而其他大分子的蛋清蛋白质被膜所截留。

改进系统的流体动力学导致溶菌酶透过的增加，从而获得较好的收率。

从蛋清中提取溶菌酶，如工艺路线图所示，取新鲜或冷冻鸡蛋清（已自然融化），检查其pH在8.0左右，过筛除杂后冷至5℃，加入724树脂在0℃—5℃条件下搅拌吸附6h左右，然后在0℃—5℃静置20h以上。

待分层后弃去上层清液，下层树脂用清水反复洗几次以除去杂蛋白，最后滤干。

在上述树脂中加入等体积pH6.5、0.15mol/L磷酸钠缓冲液，搅拌洗脱20min，过滤去除洗脱液（含杂物），再按同法处理2次。

将除杂后的树脂加入等量的10%硫酸铵溶液中搅拌洗脱30min，滤出洗脱液。

重复洗脱树脂3次，各次洗脱液混合在一起。

按洗脱液体积加入32%的固体硫酸铵粉末，搅拌溶解后于4℃—10℃滤过液，离心分出沉淀物。

将沉淀物用蒸馏水全部溶解，装入透析袋中在10℃水中透析滤过液以除去硫酸铵，收集透析液。

用4%的NaOH溶液调节pH至8.5—9.0，如有白色沉淀立即离心除去，然后用盐酸调节pH至3.5，再按体积加入5%的固体NaCl搅拌均匀，置冷处48h左右后经离心收集溶菌酶盐析物，经干燥即得溶菌酶产品。

从蛋壳中提取溶菌酶的工艺流程如图所示，取新鲜或冰冻蛋壳，用水冲洗干净后粉碎，按蛋壳量加入3/4量的1%NaCl溶液，搅拌均匀后用盐酸调节pH至6.0，继续搅拌，加热到40℃左右保持30—40min，随时调节pH至6.0。

抽提完毕后过滤收集滤液，滤渣加1/2量的1%NaCl溶液再抽提一次。

合并2次滤液，滤渣可放入下批再抽提。

所得提取液用20%—30%醋酸调节pH至4.6，在沸水中迅速加热到75℃—80℃，促使卵蛋白在等电点沉淀，速冷至室温后保持10h让沉淀物析出，然后过滤除去杂蛋白，收集滤液。

将滤液用20%NaOH溶液调节pH至6.0左右，搅拌下滴
加10%聚丙烯酸（用量为滤液的1/4）。

产生凝聚物后溶液的pH为3.0左右。

静置15—30min 使凝聚物粘附于容器底部，倾去上层清液。

往凝聚物中加入少量蒸馏水，搅拌下滴加少量Na2CO3溶液使凝聚物溶解并调节pH是4.0左右，然后滴加50%CaCl2溶液使溶菌酶离解。

过滤分离出沉淀，收集滤液沉淀物可用H2SO4处理除去CaSO4以回收丙烯酸。

然后在上述滤液中滴加20%NaOH 溶液至pH9.5，静置46h，过滤分出清液，再加NaCl至浓度达5%，静置34h后产生粗结晶。

将粗结晶用pH4.6的醋酸溶解，过滤后分出不溶物，静置再结晶，干燥即得产品。

每千克壳膜可得重结晶溶菌酶1克左右。