遗传病基因突变分析

实验四 遗传病基因突变分析
（二）PCR-SSCP法检测基因突变
一、实验目的
通过实验掌握聚合酶链反应（PCR）以及DNA单链构象多态 性分析（SSCP）等分子生物学实验方法，并了解SSCP分析法是检 测基因突变的一种基本方法。
二、实验原理
1、DNA抽提 在抽出的外周静脉血中加入枸橼酸钠抗 凝，经离心处理后可分离得到大量淋巴细 胞的细胞核。由于DNA在细胞核内是与蛋 白质形成复合物的形式存在的，因此提取 过程中必须将其中的蛋白质除去，蛋白酶K 可用于消化细胞核膜及核内蛋白质，消化 的蛋白质用饱和NaCl沉淀，核DNA最后用 酒精析出。
聚合酶链反应(PCR)
聚合酶链反应（ polymerase chain reaction，PCR） 是一种体外由引物介导的特定 DNA序列的酶扩增方法， 由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、 高速的特性，近年来得到广泛应用。全过程是基于一
套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为
DNA 模板热变性，双链 DNA 解链成单链；在低温下与引 物退火，引物与单链 DNA 互补配对；在适宜温度下 Taq DNA聚合酶催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环 25-35次，模板DNA可扩增100万倍左右，整个反应可在
⑦ 弃显影液，加入10％的乙酸定影5分钟。
⑧ 弃乙酸，在双蒸水中浸泡5分钟以上。 ⑨ 用玻璃纸包胶、干燥，观察分析及记录。
结果分析： 正常人样品目的区带有 3 条：一条双链扩增产物带 ，两条单 链带。单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，所以一般形成 两条单链带。两条单链带一般在双链带后边。对显性遗传病来 说，如有基因突变，则除了原正常单链带，另出现突变带。
引物序列及扩增产物大小
Exon PCR product size
Primer-F
Primer-R ggcctcattctcatgttctaattag
8
360
gtcctttacacactttacctgttgag
19
45 48
459
547 506
ttctaccacatcccattttcttcca
aaacatggaacatccttgtggggac
10%乙酸
10%乙醇 1%HNO3 AgNO3 蔗糖
载样缓冲液（loading buffer）
95%甲酰胺 20 mM 溴酚蓝 二甲苯氰 EDTA 少许 少许
10%APS（过硫酸胺）
临用时配
五、注意事项
1 、 SSCP 原理和操作简单，不需要特殊仪器， PCR 产物变性后无 需处理就可直接电泳。通过改变 SSCP 电泳中的各种条件，如： 加入5-10%甘油、5%蔗糖和改变温度或电压等，可将约95%的DNA 碱基改变检测出来。
3、用于SSCP的药品和试剂：
双甲基丙烯酰胺（Bis）
丙烯酰胺 TEMED 30%贮存液 Acr Bis 29 g 1 g （Acr）
溶于100ml灭菌双蒸水中
显影液 Na2CO3 双蒸水加至100ml, 甲醛 10%硫代硫酸钠 2.96 g 临用时配, 4℃冷藏。 临用时加 临用时加 54 l 10 l
(5) 银染：
利用银离子可与核酸结合的特性，在甲醛作用下银离子还原 为Ag，使凝胶中DNA条带显黑色。
① 电泳完的聚丙烯酰胺凝胶用10％的酒精浸泡5分钟 。
② 弃酒精，加入1% HNO3 3分钟，不停摇动。
③ 弃HNO3液 ，用双蒸水清洗两次。 ④ 加入AgNO3 染液 ，染色10-20分钟。 ⑤ 用双蒸水清洗一次。 ⑥ 加入显影液，至清淅的DNA单链电泳条带出现为止。
2、单链构象多态性分析 单链构象多态性(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP) 分析是一种DNA单链凝胶电泳
技术,具有快速、简便、灵敏和适用于大样本筛查的特点，可有效
检出碱基置换、缺失、插入等基因变异。 SSCP原理是在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA 迁移率除与DNA长度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构 象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的
gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc
cattcctattagatctgtcgccctac
ttgaatacattggttaaatcccaacatg cctgaataaagtcttccttaccacac
实验步骤： 1. PCR操作：
每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25l）： 双蒸水 10 X Buffer MgCl2 dTNPs Primer R+F (混合) DNA 模板 taq DNA 聚合酶 石蜡油 17.8 l 2.5 l 2 l 0.5 l 1.4 l 2 l 0.5 ul 1滴
放置在PCR循环仪上，循环参数设置为： Step 1 (1个循环) 94C 5分钟
Step 2
(30个循环)
94C
56C 72C
30秒
30秒
30秒
5 分钟
Step 3
(1个循环)
72C
2. 琼脂糖凝胶电泳: ① 配制2%的琼脂糖凝胶 配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4克的琼脂 糖粉放入后，微波炉加热熔化，冷却至60℃，加入溴化乙锭(DURED)，倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。 ② 向电泳槽中倒入1×TBE，没过胶面2mm，小心移去梳子。 ③ 取PCR扩增样品10
构象就会不同。PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，每条单
链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置 换时, 就会出现泳动变位，从而提示该片段有基因变异存在。
四、实验步骤
1、DNA抽提
2、PCR操作如下：
一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25l）： H2O 9.5 l SSCP MIX 12.5 l Primer R + F 1.5 l DNA 模板 1.5 l SSCP CON(对照),SSCP-P 石蜡油 1滴 放置在PCR循环仪上，循环参数设置为：
泳道1、3、7、8是正常对照
1、用于DNA提取药品和试剂：
2、PCR反应试剂： 10XBuffer、MgCl2、dNTPs、Taq-DNA聚合酶由所购试剂 公司统一提供。 DNA 模板：正常对照来自实验者的血液样本，基因突变样本 来自角膜营养不良症患者，共计２种突变。扩增片段长度为 223bp，为角膜营养不良症基因BIGH3第11外显子。 引物序列： Primer F：CTCGTGGGAGTATAACCAGT Primer R：TGGGCAGAAGCTCCACCCGG
(3) DNA样品的处理与加样： 7.5 l PCR 产物与 15 l loading buffer 混合后， 100 C 沸水中加热变性 8分钟，冰水浴中骤冷 10分钟，然后马上加样。 (4) 在电泳槽中，以1XTBE作为电泳缓冲液，150伏电泳约2小 时。由PCR产物的长度来决定电泳时间的长短。
3、凝胶厚度和浓度 SSCP 分析一般采用 5%-10% 的凝胶。浓度不同，突变带的相对 位置也有差异。在分析未知突变时，最好采用两种以上的凝胶浓 度，以提高突变种类的检出率。凝胶越厚，背景越深，在上样量
较多的前提下，尽量是凝胶越薄越好。
4、SSCP需要有大量的正常对照一起分析，不能仅仅只是患者的样 本。另外，还必须排除人群中的多态性。 5、硝酸银价格较贵，可回收使用，适当延长处理时间。 6、PCR 产物特异性不高时，要增加退火温度，减少退火时间及延 伸时间，降低引物和Taq DNA聚合酶的浓度，改变Mg++浓度，一般 情况下是减少浓度，减少循环次数。
l
，加入样品孔内。
④ 接通电源，一般红色为正，极黑色为负极，切记DNA样品由 负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。140V，电泳2小时左 右。 ⑤ 卸下凝胶，于紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准 PUC19/MspⅠ(marker)比较。
注意事项： 1、引物设计时长度 15～30个碱基为宜，G+C含量一般为40%～ 60%。 2、退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度高PCR反应的特异 性好；温度低，有时会有非特异性条带。 3、Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响，Mg2+浓度 低，扩增产物的特异性好，但有时产量低；Mg2+浓度高，扩增产 物的特异性差，有非特异性条带。 4、PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上25一30 次循环后，PCR产物积累即可达到最大值。在满足产物得率的前 提下，应尽量减少循环次数。
分子医学实验
闫小毅 讲师 电话：88208257 E-Mail：yanxiaoyi@zju.edu.cn
遗传病基因突变分析（一） 多重PCR法检测进行性肌营养不良症（DMD） 基因缺失 • 进行性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是肌肉组织的遗传病，特 点是进行性加重的肌肉萎缩和无力。 • 本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。
• 抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60 ％是外显子缺失突变，通常选择DMD基因中9个缺 失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。
• 本实验通过多重PCR技术筛选人类DMD基因突变。 首先设计四对引物，通过PCR分别扩增DMD基因中 4个外显子，缺失的外显子不能被扩增。外显子45 和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。
３、SSCP实验步骤
(１ )
8%的聚丙烯酰胺凝胶28ml，包括： H 2O 蔗糖 30%丙烯酰胺 14.8 ml 6% 7.5 ml
5XTBE
10%APS TEMED
5.6 ml
160 l 16 l
（２）用夹子夹好后，静置1小时聚合。聚合过程中凝胶会收缩，
所以静置一些时间，待凝胶聚合后，应加少量双蒸水。
DMD-e8,DMD-e19,DMD-e45,DMD-e48, DMD对照
实验步骤： 1. PCR操作：
每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25l）： DMD mix Primer R+F (混合) DNA 模板 石蜡油 22 l 1.5 l 1.5 l 1滴
DMD-e8,DMD-e19,DMD-e45,DMD-e48, DMD对照
Step 1
Step 2
(1个循环)
(30个循环)
94C
94C 59C 72C
5分钟
30秒 30秒 30秒
Step 3
(1个循环)
72C
5分钟
• Primer F：CTCGTGGGAGTATAACCAGT • Primer R：TGGGCAGAAGCTCCACCCGG
Product size: 223bp
2到3小时内完成。
Multiplex PCR
• 多重PCR（ Multiplex PCR ）：即在一 个PCR反应中加入多对引物，分别扩增 不同的DNA片段。 • 多重PCR可用于检测DNA缺失突变
Classica源自文库 PCR VS Multiplex PCR
• 用多重PCR检测缺失突变
多重PCR检测DMD外显子缺失
2、SSCP分析的灵敏性与核酸片段大小有关，片段越小，检测的
敏感性越高。对于小于 300bp 的片段， SSCP 可发现 90% 的变异； 而大于 350bp 的片段，则难以发现其中变异。因此小于 300bp， 尤其是150bp左右的核酸的片段更适合 SSCP分析。对于较大的片 段，可用相应的限制酶降解为小片段，然后再SSCP分析。
• DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显 子组成，编码3685个氨基酸、分子量为427 kD
的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这
种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。
DMD基因突变导致两种肌营养不良症
Becker型肌营养不良：缺失，阅读框不变；症状轻 Duchenne型肌营养不良：缺失，阅读框改变；症状严重