双水相萃取实验课件
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《双水相萃取技术》课件
影响因素
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
生物分工程双水相萃取 66页PPT文档
(3) 回收率高 提纯倍数可达2-20倍, 如体系选择适当,回 收率可达80%-90%以上,且分离速度快。
三、双水相体系的应用
应用：在生物化学、细胞生 物学、生物化工等有机物分 离提纯方面得到了较为广泛 的应用，如：分离提纯蛋白 质、生物酶、菌体、细胞、 氨基酸、抗生素以及亲水性 生物大分子等。
KS
Y2,3-BD(% ) Yacetoin(% ) Rglucose(% ) Rcells(% ) R protein(% )
1 9.88 10.19 0.031 318.7 93.0
93.5
94.9
99.6
85.5
2 9.65 10.06 0.030 321.7 93.0
93.5
94.8
99.5
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
8.3和91.4%
乙醇/硫酸铵APTE放大实验
表2.3 体系放大过程中2,3-丁二醇分配的变化
分配系数(K)
4）外加电场的影响
当在两相分界的垂直方面上加上电场时由于 电位差增加而使分配系数发生改变 如用PEG8000 /DextranＴ 500体系分离肌红蛋白,在外加48.1 Ｖ/cm的电场强度40 min后,分配系数Ｋ从0.81变 为38.7,上相回收率从44.7%增高到98.0% 。
5) 温度的影响
ln m H(H F F H S )F F S Z
RT
影响分配平衡的因素
1）成相聚合物
成相聚合物的相对分子量降低、浓度升高 有利于增大溶质的分配系数。
三、双水相体系的应用
应用：在生物化学、细胞生 物学、生物化工等有机物分 离提纯方面得到了较为广泛 的应用，如：分离提纯蛋白 质、生物酶、菌体、细胞、 氨基酸、抗生素以及亲水性 生物大分子等。
KS
Y2,3-BD(% ) Yacetoin(% ) Rglucose(% ) Rcells(% ) R protein(% )
1 9.88 10.19 0.031 318.7 93.0
93.5
94.9
99.6
85.5
2 9.65 10.06 0.030 321.7 93.0
93.5
94.8
99.5
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
8.3和91.4%
乙醇/硫酸铵APTE放大实验
表2.3 体系放大过程中2,3-丁二醇分配的变化
分配系数(K)
4）外加电场的影响
当在两相分界的垂直方面上加上电场时由于 电位差增加而使分配系数发生改变 如用PEG8000 /DextranＴ 500体系分离肌红蛋白,在外加48.1 Ｖ/cm的电场强度40 min后,分配系数Ｋ从0.81变 为38.7,上相回收率从44.7%增高到98.0% 。
5) 温度的影响
ln m H(H F F H S )F F S Z
RT
影响分配平衡的因素
1）成相聚合物
成相聚合物的相对分子量降低、浓度升高 有利于增大溶质的分配系数。
南农 生物分离工程 双水相萃取课件
双水相萃取的原理
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间 的各种相互作用，主要有 静电作用 疏水作用 生物亲和作用 分配系数是各种相互作用的和:
lnm=lnme+lnmh+lnml
me，mh，ml
分别为静电作用、疏水作用和生物亲 和作用对溶质分配系数的贡献。
1．静电作用 非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响， BrΦnsted方程推导下述分配系数表达式：
2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素 钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液 层。
葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
双水相的形成
聚合物的不相溶性(incompatibility)： 当两种高分子聚合物之间存在相互排斥 作用时，当达到平衡时，即形成分别富 含不同聚合物的两相。 除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的 混合溶液也可形成双水相，
双水相的形成
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol)
Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖(dextran)
Phase 1: 4% polyethylene glycol in water Phase 2 : 4% dextran in water
Dr = 0.2 g / cc s = 1.2 dyne / cm PEG Dextran
1 双水相中聚合物及其分子量的影响 降低聚合物的分子量，则蛋白质易分配于富含 该聚合物的相中 聚合物的疏水性按下列次序递增:
葡萄糖硫酸盐< 甲基葡萄糖< 葡萄糖<羟丙基葡聚糖 < 甲基纤维素< 聚乙烯醇<聚乙二醇< 聚丙三醇
同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加
酶双水相萃取.pptx
形
互不相容的两相，两种聚合物分别溶于两
成
相中，即构成双水相系统。这主要是由于 聚合物分子的空间位阻作用，相互间无法
过
渗透，而且有强烈的相分离倾向，在一定
程
条件下即可分为两相。一般认为，聚合物
水溶液的疏水性差异是产生相分离的主要
推动力，且蔬水性差异越大，相分离倾向
也越大。
第3页/共21页
1.2、双水相系统中作用力的表现
substrate第15页/共21页
product
Enzymetic reaction with ATPS
enzyme enzyme
第16页/共21页
enzyme
5.1、蛋白质双水相萃取的优点
两相含水量均很
高，与蛋白质有
可用于蛋白质的
很好的相容性， 且不易使蛋白质
1
精制，经过几次
4 连续的双水相萃
作用力 为斥力
形成双水相系统
双水相
作用力 形成两相，一相为两 为引力 高聚物，一相为水相 均一相
作用力无 强烈引力
完全互溶，形成均一相
和斥力
两相
第4页/共21页
1.3、几种常见的双水相体系
类型
非离子型聚合物/ 非离子 型聚合物
高分子电解质/非离子型聚 合物 高分子电解质/高分子电解 质 聚合物/ 低分子量化合物
失活。
取，得到更高纯
度的蛋白质。
所需设备简 单，且处理 容量大，利 于大规模生 产。
2
3
分离纯化后
的蛋白质产
物纯度很高，
有很大使用
价值。
第17页/共21页
5.2、蛋白质双水相萃取的缺点
系统中水的含量 高，分离后的蛋 白质液浓度低， 需要浓缩以提高 产物的浓度。
双水相萃取ppt
天然植物药用有效成分的分离与提取
中草药是我国医药宝库中的瑰宝 ,已有数千 年的历史 ,但由于天然植物中所含的化合物 众多 ,特别是中草药有效成分的确定和提取 技术发展缓慢 ,使我国传统中药难以进军国 际市场。因此 ,采用具有较高选择性和专一 性的双水相萃取技术对中草药有效成分的 提取是一项很有意义的工作。利用双水相 萃取中草药有效成分具有代表性的工作是 对黄岑甙和黄岑素的分离。
抗生素的分离与提取
数抗生素都存在于发酵液中 ,提取工艺路线复杂 ,能耗 高 ,提取过程易变性失活。而双水相萃取在抗生素中具 有较大的应用价值 ,萃取提取涉及到各类抗生素。β 内酰胺类抗生素是抗生素家族中应用最多的一类 ,主要 由青霉素类和头孢菌素类构成。对青霉素进行工业化意 义的双水相萃取是结合传统工艺溶媒萃取法进行的。先 以 PEG2000/ (NH4) 2SO4系统将青霉素从发酵液中提取 到 PEG相 ,后用醋酸丁酯(BA)进行反萃 ,再结晶 ,处理 1000ml 青霉素发酵液 ,得青霉素晶体 7. 228g ,纯度 84. 15 % ,三步操作总收率 76. 56 %。
酶工程药物的分离与提取
酶在医药方面的应用一是作为药用酶 ,二是用作化学合 成药物中的酶催化剂。迄今 ,双水相萃取技术已广泛应 用于生物大分子、细胞、细胞器、蛋白质、核酸、病毒、 细菌、蓝藻、叶绿素、线粒体、 菌体等的分离与提取 , 几乎所有的酶均可用此技术仅通过调节 pH、合物和盐的 种类或浓度 ,选择合适的分离条件就可进行理想的分离 纯化。目前双水相萃取技术已成功应用于已较大规模提 取纯化的酶有几十种 。其中成功地实现从微生物细胞碎 片中提取纯化甲酸脱氢酶 ,其分离经 4 次连续萃取 ,已 达处理 50kg 湿细胞规模 ,处理的酶蛋白含量已高达 150g ,收率为 90 %～100 % ,由于工艺简单 ,原材料成 本较低 ,产品的价格也有大幅度降低。
第四章 萃取-双水相萃取.ppt.Convertor
第二节双水相萃取主要内容一、概述二、物质在两相中的分配三、双水相萃取工艺流程四、双水相萃取技术的应用一、概述过滤和离心技术（取决于分离颗粒的尺寸或密度差异）难于进行收集微生物的细胞器、分离除去细胞碎片、提取和浓缩胞内物质的操作。
萃取已广泛用于液液分离，但一般的有机溶剂萃取难于分离蛋白质：（1）许多蛋白质有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；（2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
在一定条件下，水相也可形成两相甚至多相。
使将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中成为可能。
1、最早的双水相萃取现象:1896年Be jerinck，把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合，可分为两相（大部分明胶/大部分琼脂），聚合物的“不相溶性”。
多种不相溶的聚合物可得到多相体系。
原因？（1）聚合物的空间阻碍作用，相互间无法渗透。
（2）聚合物与无机盐可形成聚合物-盐双水相。
2、双水相萃取的优势（见表，有一系列数据说明问题）3、双水相萃取的特点：(1) 条件温和，保留产物活性；(2) 含水量高，表面张力低，耗能少(3) 大分子及小分子（红霉素、氨基酸等）萃取；(4) 易于放大(5) 影响因素复杂；(6) 成本高4、两水相体系形成聚合物混合时，是分层或成一相，取决于两种因素：一是体系熵增加，表明系统混沌程度的量，与分子数量有关；二是分子间作用力，与分子量有关，分子量越大，分间作用力也越大。
分子之间作用力：（1）A-A >A-B 相分离（2）A-A<A-B 混合（3）A-B>>A-A凝聚复合5、两水相体系类型两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）6、相图（见课件中图）理解：双结线(TKB)；；结点(T/B)；临界点(K)；系线(TB)上相（T，轻相）；下相（B，重相）当M点下移时，系线长度缩短，两相差别减小，到K点时，系线长度为0，两相差别消失而成为一相。
双水相萃取课件
双水相萃取的原理
根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但 分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增 大而增大。
当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对
分子质量较大的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位，
即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当
越广泛。
目前，双水相萃取技术已用于多种生物体、生
物组织以及大分子生物物质的分离与纯化，并取
得了较好地成效。
1、双水相萃取常用设备
双水相萃取的基本过程包括双水相的形成、溶 质在双水相中的分配和双水相的分离。 相混合设备 静态混合器是常用的相混合设备。
相分离设备
在双水相系统中，虽然两相较容易达到平衡， 但两相分离则比较困难，这是因为两相的密度差 小，且粘度较大。 达到分配平衡的两相进行分离时，采用重力沉 降法或离心沉降法。一般用离心沉降法。常用的 离心沉降设备有管式离心机和碟片式离心机。
双 水 相 萃 取
主要内容
双水相萃取及萃取的设备工艺流程
1 2 双水相体系的形成 相图 双水相中的分配平衡
3
4 影响双水相分配系数的主要因素
有机溶剂萃取的不足: 1.许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机剂 ；
2.蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定 条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多 相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物 质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务
1）表面自由能的影响（大分子物质表面性质对K 影响很大） 2）表面电荷的影响（盐效应：两相系统中存在如 盐，对K影响很大） 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难 ，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数
《两水相萃取法》PPT课件
精选ppt
17
当系线向下移动时，长度逐渐减小，这说明两相的差别 减小，当达到K点时，系线的长度为0，两相间差别消失， 点K称为临界点或褶点。
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18
双节线的位置形状与聚合物的分子量有关。分子量越高， 相分离所需的浓度越低；两种聚合物的分子量相差越大，双 节线的形状越不对称。
精选ppt
19
三、分配理论
精选ppt
46
如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流 过程操作方法下，用超滤或渗析的膜过滤回收。
膜分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物 的最佳方法。
精选ppt
47
如果蛋白质积聚在聚乙二醇中，可以通过加入盐来精 制，加入的盐导致蛋白质在盐相中重新分配。
PEG的分离同样可以用膜分离来实现，即用选择性孔 径较大的半透膜来截留蛋白质，同时排除PEG进行回收。
精选ppt
30
如上所述，影响分配系数的因素很多，而且这些 因素相互间又有影响，因此，目前尚不可能定量地关 联分配系数与能独立测定的蛋白质的一些分子性质之 间的关系。适宜的操作条件，只能通过实验得到。
实验可很方便地在10 ml有刻度的离心试管中进 行。如检定工作跟得上，则在几天内就可求得所需的 萃取条件。但有时液体粘度比较大，用吸管操作时容 易引起误差，需要注意。
精选ppt
43
（五）、温度
温度影响相图，特别在临界点附近，尤为显著，因而 也影响分配系数。但是在离临界点较远时，这种影响较小。
大生产中，总采用常温，可节约冷冻费用，这是由于 聚合物对蛋白质有稳定作用，不会引起损失。同时，温度 高时，粘度较低，有利于相的分离操作。
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44
（六）、荷电PEG作为成相聚合物
双水相萃取详细资料(ppt 44页)
双水相萃取
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
➢大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 ➢蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 ➢有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
使蛋白质易分配于富含该PEG的相中，使分配系数 增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降 低，这是一条普遍规律
这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲 水性物质的分配产生较大的影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增大而 增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓 度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏 水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含 PEG相中聚集，而转向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易分配 于富含PEG的相了
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
➢大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 ➢蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 ➢有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
使蛋白质易分配于富含该PEG的相中，使分配系数 增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降 低，这是一条普遍规律
这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲 水性物质的分配产生较大的影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增大而 增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓 度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏 水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含 PEG相中聚集，而转向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易分配 于富含PEG的相了
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
《双水相萃取》课件
食品加工过程优化
通过双水相萃取技术优化食品加工过程，提高食品的产量和品质， 降低能耗和资源消耗。
在环境保护领域的应用实例
1 2 3
废水处理
双水相萃取技术用于废水处理，通过分离和富集 废水中的有害物质，降低废水处理成本和提高处 理效果。
土壤修复
双水相萃取技术用于土壤修复，通过分离和富集 土壤中的重金属离子和有害有机物，降低土壤污 染风险。
双水相萃取技术中使用的聚合物在长期使 用过程中可能会出现降解、交联等问题， 影响分离效果。
成本较高
工艺参数控制严格
双水相萃取技术中使用的聚合物和设备成 本较高，增加了生产成本。
双水相萃取技术的工艺参数控制较为严格 ，需要精确控制温度、pH值等条件，否则 会影响分离效果。
双水相萃取技术的发展趋势
新型聚合物的研发
双水相萃取技术的应用领域
01
02
03
04
05
应用领域
1. 生物活性物质 2. 天然产物的提 3. 环境污染物的 4. 化学反应的分
的分…
取和…
去除…
离和…
双水相萃取技术广泛应用 于生物医药、食品、环保 、化工等领域。
如蛋白质、酶、细胞、病 毒等的分离和纯化。
如中药、天然色素、天然 香料等的提取和分离。
放射性核素分离
双水相萃取技术用于放射性核素的分离与富集， 为核工业和核医学领域提供技术支持。
CHAPTER 05
结论
对双水相萃取技术的总结
技术原理
双水相萃取技术利用物质在双水相间的分配原理 ，实现目标成分的分离和纯化。
应用领域
广泛应用于生物医药、食品、化工等领域，用于 分离和纯化蛋白质、酶、细胞等生物大分子。
通过双水相萃取技术优化食品加工过程，提高食品的产量和品质， 降低能耗和资源消耗。
在环境保护领域的应用实例
1 2 3
废水处理
双水相萃取技术用于废水处理，通过分离和富集 废水中的有害物质，降低废水处理成本和提高处 理效果。
土壤修复
双水相萃取技术用于土壤修复，通过分离和富集 土壤中的重金属离子和有害有机物，降低土壤污 染风险。
双水相萃取技术中使用的聚合物在长期使 用过程中可能会出现降解、交联等问题， 影响分离效果。
成本较高
工艺参数控制严格
双水相萃取技术中使用的聚合物和设备成 本较高，增加了生产成本。
双水相萃取技术的工艺参数控制较为严格 ，需要精确控制温度、pH值等条件，否则 会影响分离效果。
双水相萃取技术的发展趋势
新型聚合物的研发
双水相萃取技术的应用领域
01
02
03
04
05
应用领域
1. 生物活性物质 2. 天然产物的提 3. 环境污染物的 4. 化学反应的分
的分…
取和…
去除…
离和…
双水相萃取技术广泛应用 于生物医药、食品、环保 、化工等领域。
如蛋白质、酶、细胞、病 毒等的分离和纯化。
如中药、天然色素、天然 香料等的提取和分离。
放射性核素分离
双水相萃取技术用于放射性核素的分离与富集， 为核工业和核医学领域提供技术支持。
CHAPTER 05
结论
对双水相萃取技术的总结
技术原理
双水相萃取技术利用物质在双水相间的分配原理 ，实现目标成分的分离和纯化。
应用领域
广泛应用于生物医药、食品、化工等领域，用于 分离和纯化蛋白质、酶、细胞等生物大分子。
双水相萃取法PPT课件( 57页)
该式较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间电
位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的影响， 同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性和相间电位 的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。
3. 影响物质分配平衡的因素
影响物质在双水相系统中分配的因素主要有双水相 系统的聚合物组成(包括聚合物类型、平均分子量)，盐 类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值)，溶质的 物理化学性质(包括分子量、等电点)以及体系的温度等。 然而，这些参数并不是独立地起作用。所以要预测溶质 在双水相系统间的分配系数是困难的。这些系统复杂性 表现在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基团会 影响离子的分配和电位，在大分子(亲水聚合物或蛋白 质溶质)结构中构象的变化，能使另一些原子暴露在微 环境中。这些事实导致只能用实验的方法来确定满足分 配要求的操作条件。
2．疏水作用
一般蛋白质表面均存在疏水区，疏水区占总表 面积的比例越大，疏水性越强。所以，不同蛋白质 具有不同的相对疏水性。在pH为等电点的双水相中， 蛋白质主要根据表面疏水性的差异产生各自的分配 平衡。同时，疏水性一定的蛋白质的分配系数受双 水相系统疏水性的影响。因此，有必要确定双水相 系统的疏水性尺度，以便在萃取操作时调整和设计 蛋白质的分配系数。PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相 系统的上相(PEG相)疏水性较大，相间的疏水性差用 疏水性因子HF (hydrophobic factor)表示。HF可通 过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系 数maa测算
已有的大量研究表明，生物分子的分配系数取决于溶 质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电 作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数 是各种相互作用的和:
lnm=lnme+lnmh+lnml
双水相萃取与应用课件
• 溶剂对目标组分选择性强，大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程简化，易于工业放大和连续操作。
• 分相时间短，常温常压下自然分相时间一般为5-10min。
• 目标产物的分配系数一般大于3，大部分情况下目标产物的收率较高。
• 聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度，以及体系的pH值等多种因素都可以对被萃取物质在两相的分配产生影响，因此 可以利用多种手段来使反应达到最佳条件。
双节线
葡聚糖（%） PEG/葡聚糖系统相图
相图中TCB连线为一双节线，双节线下方为单相区； 双节线上方为两相区。如果系统组成处于该区，如M点时， 系统分为两相，而上相和下相的组成分别为通过M点与双 节线相交的T和B点相对应的组成。上相主要含有PEG，下 相主要含有葡聚糖或盐。两相平衡时，符合杠杆规则。 当用υ T代表上相体积，υ B代表下相体积时，则
A
聚乙二醇(PEG)
几种典型双水相系统
B C
硫酸葡聚糖酸钠 羧甲基葡聚糖酸钠 羧甲基葡聚糖酸钠
D
聚乙二醇
A, B, C, D, E,
聚乙二醇 葡聚糖 两者均为非离子性聚合物, 一种非离子性聚合物，另一种为带电荷的聚电解质 两者均为聚电解质, 一种聚合物，另一种为盐。 一种聚合物，另一种为有机小分子
E
某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合，两者浓度达到一定值时， 也会分为两相，形成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一种解释为“ 盐析”作用。 无机盐和简单的有机盐均可，其成相相对能力与其盐析能力次序基 本一致。阴离子作用比阳离子重要，多原子离子比单原子离子更有效， 成相浓度低。大而电荷密度低的单原子阴离子容易与PEG分子中 的氧 偶极子发生作用，成相浓度高，无法使用。但它们可以作为中性盐添加 组分加入聚合物/聚合物和聚合物/盐系统中，用于改变分配系数。 对于聚合物/盐系统，因盐比葡聚糖便宜得多，使得聚乙二醇(PEG)/ 盐系统具有工业上应用优势。
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生化物质分离纯化基础实验
二. 操作方法
（一）蛋白质在两相中的分配：
10ml刻度 离心试管
加(NH4)2SO4 固体1.30克
加PEG400 2.00克
加入糖化酶 2.00ml
加水
振摇混和 (固体溶解)
离心 3000转/分
5min
求蛋白质分配系数
数____g__℃ ml
累计量 g 计总量
g
g
PEG (NH4)温2SO度4 =
%(g/g) %(g/g)
1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5
5
生化物质分离纯化基础实验
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同
标准曲线图： OD OD = K · μg ＋ b 求斜率K和截距b
μg
上相
C上
OD b K
100
g / ml
下相
OD b 1
C下
K
0.1
g / ml
11
生化物质分离纯化基础实验
● 思考和讨论:
一. 加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全 部溶解，原因是什么？
二. 选择正确的离心操作顺序: 1. 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放 在离心机中。 2. 将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。
二. 相图的制作方法
(一) 溶液配制
配制43.00%（g/ml）的（NH4)2SO4溶液：
称硫酸胺 215.0g
少量水 溶解
稀释至 500ml
密度计测 密度
3
生化物质分离纯化基础实验
（二）相图的制作
PEG400 0.700g
H2O 0.5ml
(NH4)2SO4
混和
H2O 0.3ml
混均
按表格重复操作…
生化物质分离纯化基础实验
两水相萃取蛋白质的相图 及分配系数
1
生化物质分离纯化基础实验
PEG/(NH4)2SO4两水相系统的相图
一. 实验原理
高聚物与无机盐成相的原因：无机盐盐析作用。
用相图表示两水相形成的条件和定量关系， 它是一根双节线（binodal）。
P 两相区
互溶区 Q
2
生化物质分离纯化基础实验
牛血清牛蛋血白清浓蛋白度ml1200.2g 0/.m4l 0.6
H2O ml 0.8 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 /
上相液1.0ml 下相液0.1ml
/
0.9ml
加考马斯亮兰5.00ml，混匀，25℃±1℃保温10分钟，冷却
蛋白质总重g
/
/
OD（595nm） 10
生化物质分离纯化基础实验
澄清
浑浊 记录(NH4)2SO4
ml数
PEG400%
4
(NH ) SO %
生化物质分离纯化基础实验
表1. 相图制作表
(NH4)2SO4溶液浓度 43.00 % (g/ml) /ml溶液
密度 1.20 g 溶液
次PEGH420O0 (=NH_4)_2S_O_4溶__液加g 量 纯(NH4)2SO4 溶液累
三. 选择正确的吸出上、下相操作方法：
1. 吸管小心插入下相，吸出下相 上相。
换吸管，吸出
2. 吸管小心吸出上相
插入下相，吸出下相。
3. 吸管小心吸出上相
将多余上相和少量下相弃
ห้องสมุดไป่ตู้
去 换吸管，吸出下相。
12
生化物质分离纯化基础实验
四. 可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）： 1. 要吸取0.4ml液体，可用1000 ~ 5000 μl 规格
K = C上/ C下
8
总重8.00g 求相比 R =V上/V下
生化物质分离纯化基础实验
（二）比色测定上、下相蛋白质浓度：
◆ 试剂配制 1. 考马斯亮兰G-250溶液配制：
精确称取50mg考马斯亮兰，溶于10ml 95%乙醇中，并 加入50ml 85% 浓磷酸，然后，用H2O稀释定容至500ml。 2. 牛血清蛋白溶液配制：
精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl, 溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成 120g/ml的牛血清蛋白原液。
9
生化物质分离纯化基础实验
◆ 标准曲线制作方法：见下表
◆ 上相液：吸取0.5ml
蒸馏水定容至50ml
按
下表操作。
下相液：直接按下表操作。
空白液：吸取1.0ml 蒸馏水 ＋ 5ml 考马斯亮兰液。 表1. 标准曲线和样品的测定
程度地分配，分配系数 K = C上/ C下。 = V上/ V下
相比R
2. 考马斯亮兰（Coomassie Brilliant Blue G250） 比色法测定两相中蛋白质浓度：考马斯亮兰G －250是一种染料，酸性溶液中呈棕红色。与蛋白质 通过范德华键结合成兰色复合物，595nm波长有最大 吸收值。
的枪。
2. 向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋，数值 增 大。
3. 下列操作哪一个正确： (a) 吸液时向下按到第一停点；放液时向下按到第 二停 点。 (b) 吸液时向下按到第二停点；放液时也向下按到
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生化物质分离纯化基础实验
二. 操作方法
（一）蛋白质在两相中的分配：
10ml刻度 离心试管
加(NH4)2SO4 固体1.30克
加PEG400 2.00克
加入糖化酶 2.00ml
加水
振摇混和 (固体溶解)
离心 3000转/分
5min
求蛋白质分配系数
数____g__℃ ml
累计量 g 计总量
g
g
PEG (NH4)温2SO度4 =
%(g/g) %(g/g)
1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5
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生化物质分离纯化基础实验
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同
标准曲线图： OD OD = K · μg ＋ b 求斜率K和截距b
μg
上相
C上
OD b K
100
g / ml
下相
OD b 1
C下
K
0.1
g / ml
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生化物质分离纯化基础实验
● 思考和讨论:
一. 加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全 部溶解，原因是什么？
二. 选择正确的离心操作顺序: 1. 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放 在离心机中。 2. 将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。
二. 相图的制作方法
(一) 溶液配制
配制43.00%（g/ml）的（NH4)2SO4溶液：
称硫酸胺 215.0g
少量水 溶解
稀释至 500ml
密度计测 密度
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生化物质分离纯化基础实验
（二）相图的制作
PEG400 0.700g
H2O 0.5ml
(NH4)2SO4
混和
H2O 0.3ml
混均
按表格重复操作…
生化物质分离纯化基础实验
两水相萃取蛋白质的相图 及分配系数
1
生化物质分离纯化基础实验
PEG/(NH4)2SO4两水相系统的相图
一. 实验原理
高聚物与无机盐成相的原因：无机盐盐析作用。
用相图表示两水相形成的条件和定量关系， 它是一根双节线（binodal）。
P 两相区
互溶区 Q
2
生化物质分离纯化基础实验
牛血清牛蛋血白清浓蛋白度ml1200.2g 0/.m4l 0.6
H2O ml 0.8 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 /
上相液1.0ml 下相液0.1ml
/
0.9ml
加考马斯亮兰5.00ml，混匀，25℃±1℃保温10分钟，冷却
蛋白质总重g
/
/
OD（595nm） 10
生化物质分离纯化基础实验
澄清
浑浊 记录(NH4)2SO4
ml数
PEG400%
4
(NH ) SO %
生化物质分离纯化基础实验
表1. 相图制作表
(NH4)2SO4溶液浓度 43.00 % (g/ml) /ml溶液
密度 1.20 g 溶液
次PEGH420O0 (=NH_4)_2S_O_4溶__液加g 量 纯(NH4)2SO4 溶液累
三. 选择正确的吸出上、下相操作方法：
1. 吸管小心插入下相，吸出下相 上相。
换吸管，吸出
2. 吸管小心吸出上相
插入下相，吸出下相。
3. 吸管小心吸出上相
将多余上相和少量下相弃
ห้องสมุดไป่ตู้
去 换吸管，吸出下相。
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生化物质分离纯化基础实验
四. 可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）： 1. 要吸取0.4ml液体，可用1000 ~ 5000 μl 规格
K = C上/ C下
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总重8.00g 求相比 R =V上/V下
生化物质分离纯化基础实验
（二）比色测定上、下相蛋白质浓度：
◆ 试剂配制 1. 考马斯亮兰G-250溶液配制：
精确称取50mg考马斯亮兰，溶于10ml 95%乙醇中，并 加入50ml 85% 浓磷酸，然后，用H2O稀释定容至500ml。 2. 牛血清蛋白溶液配制：
精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl, 溶于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成 120g/ml的牛血清蛋白原液。
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生化物质分离纯化基础实验
◆ 标准曲线制作方法：见下表
◆ 上相液：吸取0.5ml
蒸馏水定容至50ml
按
下表操作。
下相液：直接按下表操作。
空白液：吸取1.0ml 蒸馏水 ＋ 5ml 考马斯亮兰液。 表1. 标准曲线和样品的测定
程度地分配，分配系数 K = C上/ C下。 = V上/ V下
相比R
2. 考马斯亮兰（Coomassie Brilliant Blue G250） 比色法测定两相中蛋白质浓度：考马斯亮兰G －250是一种染料，酸性溶液中呈棕红色。与蛋白质 通过范德华键结合成兰色复合物，595nm波长有最大 吸收值。
的枪。
2. 向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋，数值 增 大。
3. 下列操作哪一个正确： (a) 吸液时向下按到第一停点；放液时向下按到第 二停 点。 (b) 吸液时向下按到第二停点；放液时也向下按到
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