液体活检技术在肿瘤诊断领域的研究进展

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４３８６．２０１６．０６．００７作者单位：１５００８１，哈尔滨医科大学医学遗传学研究室通信作者：于旸（Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｙａｎｇ＠ｅｍｓ．ｈｒｂｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）・综述・

液体活检技术在肿瘤诊断领域的

研究进展

孙宇乔　贾学渊　于旸

【摘要】　近年随着人们对循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）和循环肿瘤ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）的认识逐渐加深，一种新兴的以血液为基础的肿瘤分子诊断应时而生。液体活检（Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ）提供了一种无创性获得肿瘤相关信息的方式，具有安全，高效，实时等特点。相对于传统组织活检而言，液体活检的出现带来了新的机遇与挑战，其在肿瘤的早期诊断、临床分期、疗效评估和个体化治疗等方面体现出巨大的临床应用前景。虽然液体活检目前尚未在临床上普及，但随着技术的发展，液体活检必将迅速成为精确医学的核心部分。

【关键词】　液体活检；　肿瘤；　循环肿瘤细胞；　循环肿瘤ＤＮＡ

基金项目：国家自然科学基金（８１２７２２８８）；教育厅科学技术研究项目（１２５４１３９６）；黑龙江省卫生厅一般项目（２０１３１６１）；黑龙江省博士后资助项目（ＬＢＨ－Ｚ１５１５５）

Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｔｕｍｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓ

ＳｕｎＹｕｑｉａｏ，ＪｉａＸｕｅｙｕａｎ，ＹｕＹａｎｇ

（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＨａｒｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００８１，Ｃｈｉｎａ）

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＹｕＹａｎｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｙａｎｇ＠ｅｍｓ．ｈｒｂｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｓｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ（ＣＴＣｓ）ａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ａｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｂｌｏｏｄａｎａｌｙｓｉｓｅｍｅｒｇｅｓ．Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｉｓａｍｅｔｈｏｄｔｏｏｂ－ｔａｉｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓａｆｅｔｙ，ｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｒｅａｌｔｉｍｅ．Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｐｒｏｖｉｄｅｓｎｅｗｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｔｉｓｓｕｅｂｉｏｐｓｙ．Ｉｔｈａｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄａｒｅｍａｒｋａｂｌｙｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌｓｔａｇｅ，ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅ－ｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｕｓｅｄｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙｙｅｔ；ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｔｗｉｌｌｃｅｒｔａｉｎｌｙｂｅｃｏｍｅｏｎｅｏｆｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｐａｒｔｓｏｆｐｒｅｃｉｓｉｏｎｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｎｅａｒｆｕｔｕｒｅ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ；　Ｔｕｍｏｒ；　ＣＴＣｓ；　ｃｔＤＮＡ

Ｆｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１２７２２８８）；ＴｈｅＥｄｕｃａｔｉｏｎＡｇｅｎ－ｃｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（１２５４１３９６）；ＴｈｅＨｅａｌｔｈＡｇｅｎｃｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（２０１３１６１）；ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌＧｒａｎｔ（ＬＢＨ－Ｚ１５１５５）

肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，医生通常采用组织活检的方法对患者进行检测与诊断。虽然组织活检是诊断肿瘤的金标准，但不可否认这种方式也存在一些弊端，如对患者造成的创伤较大，易导致肿瘤转移等。近年，随着肿瘤的液体活检这一分子诊断的概念被提出，并且备受关注，液体活检有望迅速进入临床指导肿瘤的诊断与治疗。液体活检是指对患

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者血液样本中的细胞和核酸的检测，主要包括循环肿瘤细胞和循环肿瘤ＤＮＡ两类。本文从以下３个方面对液体活检在肿瘤诊断领域的研究进展进行总结：液体活检的检测对象、检测手段与临床应用前景。

１　液体活检的检测对象

１．１　循环肿瘤细胞

早在１８６９年，Ａｓｈｗｏｒｔｈ［１］曾在肿瘤患者外周血中发现与原发病灶性质相似的细胞，这是循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）概念的雏形。随着研究的进一步深入，循环肿瘤细胞被明确定义为从原发肿瘤组织或转移肿瘤组织中脱落，逃离宿主免疫杀伤，并进入血液循环的肿瘤细胞。其最基本的特点是高度异质性，并可通过多种技术被检测到［２］。在过去的１０年中，大范围的临床调查已证明ＣＴＣｓ计数可以提示乳腺癌［３］、前列腺癌［４］等多种癌症的预后；ＣＴＣｓ计数也可被用作检测化疗疗效的生物标志物，并能预测肿瘤患者的治疗效果［５］。１．２　循环肿瘤ＤＮＡ

１９４８年Ｍｅｎｄｅｌ和Ｍｅｔａｉｓ等［６］首次发现了细胞游离核酸（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ，ｃｆＮＡｓ）的存在。ｃｆＮＡｓ包括细胞游离ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ

ＤＮＡ，ｃｆＤＮＡ）、细胞游离ｍＲＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｍＲＮＡ，ｃｆＲＮＡ）和循环ｍｉＲＮＡ。随后在多种疾病的患者中都检测到了ｃｆＮＡｓ，如炎症、自身免疫性疾病、心肌梗塞和癌症等［７］。源于原发肿瘤或转移肿瘤组织派生的ｃｆＤＮＡ称为循环肿瘤ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）［８］。肿瘤患者体内的ｃｔＤＮＡ远高于健康个体［９］，且肿瘤释放的ｃｔＤＮＡ携带与肿瘤细胞相同的突变，因此可被当作肿瘤标志物［１０］。

２　液体活检的检测方法

２．１　循环肿瘤细胞的检测

分析ＣＴＣｓ时最大的困难是缺乏起始材料。ＣＴＣｓ在血液中含量极低，一位转移肿瘤患者的１ｍＬ血液中含有数百万的白细胞和十几亿的红细胞，而在如此众多的细胞中，能被检测到的ＣＴＣｓ一般不超过１０个。早期肿瘤患者的ＣＴＣｓ数量可能更少，这使ＣＴＣｓ几乎不可直接探查［１１］。近年ＣＴＣｓ的研究取得了飞速的发展，其中很重要的原因是ＣＴＣｓ的检测手段有了很大的进步。现在针对ＣＴＣｓ的检测流程主要包括两部分：ＣＴＣｓ的分离与富集，以及ＣＴＣｓ的分析检验。

２．１．１　循环肿瘤细胞的分离与富集　ＣＴＣｓ的分离和富集主要基于其物理性质和免疫学特性。由于ＣＴＣｓ与正常血细胞密度和大小存在差异，可利用密度梯度离心法［１２］和滤过膜分离法［１３］将其分离并富集。此外，由于某些生物标志物（如甲胎蛋白，上皮细胞黏附分子等肿瘤相关因子）在ＣＴＣｓ和血细胞间存在表达差异，可针对这些标志物的抗原利用流式细胞仪进行分选，也可利用有特异性抗体的磁珠与之结合，并在外加磁场的作用下富集ＣＴＣｓ。其中Ｖｅｒｉｄｅｘ针对上皮细胞黏附分子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＥｐＣＡＭ）使用相应抗体包被的磁珠进行免疫分离，发明了用于富集ＣＴＣｓ的ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ系统，并且已经获得了美国食品药品监督局（ｆｏｏｄａｎｄｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ）批准可以应用于临床［１４］。

２．１．２　循环肿瘤细胞的分析检验　通常经过分选后富集到的细胞中仍含有大量白细胞，需要进一步进行分析验证。将富集到的细胞应用荧光素标记的抗角蛋白（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，ＣＫ）抗体和抗白细胞共同抗原ＣＤ４５抗体进行荧光标记，同时用ＤＡＰＩ对细胞核进行染色，利用荧光显微镜对成像进行分析，其中表现为ＣＫ＋／ＣＤ４５－／ＤＡＰＩ＋的细胞可以被确定为循环肿瘤细胞［１５］。再对确定的ＣＴＣｓ进行上皮免疫斑点检测（ｅｐｉ－ｔｈｅｌｉａｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ，ＥＰＩＳＰＯＴ）将凋亡细胞去除，保留具有功能的循环肿瘤细胞用于临床分析［１６］。２．２　循环肿瘤ＤＮＡ的检测方向与手段

从生物特性的角度看，循环肿瘤ＤＮＡ（ｃｉｒ－ｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）携带大量肿瘤相关信息。ｃｔＤＮＡ通过微柱吸附，磁珠吸附等方法分离后，主要通过分析ｃｆＤＮＡ的含量和体细胞突变获取肿瘤相关信息。

２．２．１　循环肿瘤ＤＮＡ含量　研究表明ｃｔＤＮＡ的含量与肿瘤大小［１２］，肿瘤分化程度［１７］，以及

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