分子克隆载体与宿主

绿色荧光蛋白基因（GFP）
GFP是由水母产生的一种可发光的蛋白质
问题
1.一个质粒含有四环素抗性基因（tetr）和LacZ基因，
tetr内有一Hind III位点，LacZ中有一EcoR I位点。如
用这两种限制性核酸内切酶切割载体一并连接入相应 的外源片段，则带有该重组质粒的细胞将（）。 A.有四环素抗性，在X-gal平板上呈现蓝色 B.对四环素敏感，在X-gal平板上呈现蓝色 C.有四环素抗性，在X-gal平板上呈现白色 D.对四环素敏感，在X-gal平板上呈现白色
通常以 LacZα作为载体的遗传标记基因，而由 宿主细胞表达β链
葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
β-葡萄糖苷酸酶可将X-Gluc降解为 兰色产物
适用范围十分广泛，因为许多生物 中没有这种基因
荧光素酶基因
荧光素酶或由萤火虫产生，可催化荧光 素氧化，并产生荧光
或 由 发 光 细 菌 （ Photobacterium fischeri）产生
Leabharlann Baidu 氯霉素抗性基因（Cmr）
抑菌剂，Chlorophenicol可结合在核糖体 50 S亚基上，阻止蛋白质合成。
Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使 氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不 能结合在核糖体上。
卡那霉素(Kanr)、 新霉素(Neor)、G418 抗性基因(G418r)
杀 菌 剂 ， Kanamycin ， Neomycin 和 G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗 生素，可结合在核糖体上，导致mRNA 发生错读。
源片段，ORF遭到破坏时，产物即不能表达。
第二节 大肠杆菌克隆载体
主要内容
一. 质粒载体 二. λ载体 三. cos 质粒 四. 细菌人工染色体
质粒载体
1.质粒的基本特性 2.质粒的改造、构建与使用 3.质粒的分类及用途 4.常用的质粒载体
1. 质粒的基本特性
四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋 白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素 分子进入细菌细胞。
氨苄青霉素抗性基因（Apr）
杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞 膜上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰 细胞分裂，杀死细胞。
Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细 胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的水解， 使氨苄青霉素失活。
至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重 组DNA分子是否进入宿主细胞
至少应有一个限制酶识别位点，以供外源DNA 插入
具有较小的分子量和较高的拷贝数
具有对受体细胞的可转移性, 提高载体导入受 体细胞的效率
5.遗传标记基因
标记基因的作用 标记基因的种类 常用的标记基因
来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基 因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能 进入细胞内。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
◇ β—半乳糖苷酶基因编码1021个 氨基酸 ◇ 其氨基末端称为α链，羧基末端称为β链 ◇ α链负责将β链装配为四聚体 ◇ 单独的β链不具酶活性，只有在α链的帮助下组
装成β4才具有酶活性——α-互补作用 ◇ 为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)
β—半乳糖苷酶基因的优点
◇酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观
5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-galactoside
◇LacZα和β链基因的分别表达可使载体小 而容量的大
第二章 分子克隆载体与宿主
Vecotrs and Host Cells
主要内容
第一节 分子克隆载体的特点 第二节 大肠杆菌克隆载体 第三节 真核细胞的克隆载体 第四节 宿主系统
第一节 分子克隆载体的特点
1.载体的定义 2.分子克隆载体的功能 3.发展概况 4.载体的特点 5.遗传标记基因
2.LacZ基因通常用于构建质粒载体的目的是什么？（） A. 编码一种限制性内切核酸酶，在转化细胞时用于切
割载体
B. 编码蓝色色素产物，可用于示踪转化的细胞 C.编码一种酶，将RNA转化为DNA D.编码一种抗生素抗性的酶 E.编码一种可检测的酶，当基因内部的位点插入任何外
质粒是一类存在于细菌细胞中能独立于染 色体DNA而自主复制的共价,闭合,环状双 链DNA分子 (1~500 kb)
(Covalently closed circular DNA, cccDNA)
Plasmids: smaller cycles of doublestrand DNA that do not carry essential genes
第一阶段（1977年前）：天然质粒和 重组质粒的利用 如pSC101, ColE1, pCR, pBR313
第二阶段：增大载体容量，建立多克 隆位点区和新的遗传标记基因
第三阶段：进一步完善载体的功能以 满足基因工程克隆中的不同要求
4.载体的特点
至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物 体中有效复制，稳定遗传
1.分子克隆载体的定义
分子克隆载体(vector)是一类可供外 源DNA插入并携带重组DNA分子进 入适当宿主细胞的DNA分子
2.分子克隆载体的功能:
为外源基因提供进入受体细胞的转移 能力
为外源基因提供在受体细胞的复制或 整合能力
为外源基因提供在受体细胞中的扩增 和表达能力
3.发展概况
1). 具有自己的复制起始位点 (Origing)(ori) 和 控制复制频率的控制基因及编码基因，形成独立 复制子 (Replico) 结构。
2）可扩增性。 ▲严紧型复制质粒 (Stringent) 每个细胞复制1-5 个质粒拷贝。 ▲松弛型复制质粒 ( Relaxed) 具有高拷贝数30-50个。
标记基因的作用：
指示外源DNA分子（载体或重组分子） 是否进入宿主细胞
指示外源DNA分子是否插入载体分子形 成了重组子
标记基因的种类： 抗性标记基因 营养标记基因 生化标记基因
常用的遗传标记基因
四环素抗性基因（Tcr）
抑菌剂，Tetracycline 可结合在核糖 体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制 核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合 成，细胞停止生长。