基因功能的研究方法概要

所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的 分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。 上述传统遗传学分析的原理同样可用来设 计从基因到表型的研究。如果我们能找到 某种方法，根据待测基因的顺序使生物体 内该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型 变异。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） 概念：基因敲除除可中止某一基因的 表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法
三、其他的基因功能研究方法 １．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization)
2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质 之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map）
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
3．内含子归巢突变 4．基因的超表达用于功能检测 5. 反义RNA
5.1 反义RNA的分类和作用机制 5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA )
5.3 反义RNA的功能
5.3.1 调控细菌基因的表达 5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制 5.3.3 IS10转位作用的抑制
1．基因失活是功能分析的主要手段
传统的遗传分析主要借助突变型研究表型 变异的遗传基础，利用紫外线诱导及化学 试剂处理可使生物群体产生突变个体，也 可从自然的群体中发现突变体。 经遗传分析将突变基因定位，然后观察这 一突变体是否与改变的表型对应。在此基 础上采用分子生物学方法进一步分离与克 隆目标基因。
同源性分析可以给出整个基因或 某一区段功能的信息
同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA 顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多 种，而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要 比核苷酸的差异大的多。 以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更 加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的 是BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子 邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会 得到回音。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因； 2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。 3. 一致性常指同一位臵同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
第十章.基因功能的研究方法 （一）
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out） 1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
一、计算机预测基因功能
计算机预测基因功能的依据仍然是同 源性比较。同源基因都有1个共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序。 同源基因可以分为2类：
种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之 前的同一祖先。 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种 生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的 不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形 成之后，也可能出现于物种形成之前。 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因 为这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但 它们有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸 位臵是相同的。 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从 数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的 相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出 现局部相似的区段。这种情况表明，2个无 亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相 似的顺序是功能的核心区域。 虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却 有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔， 在进化中一方面发生独立突变，另一方面又 因基因组重排成为新基因的组成部分。例如 信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基 本的功能域，即接受信号的功能域和传达信 号的激酶域。
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题
就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。 一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们 所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如 大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前 已经完成了大量常规的遗传学分析，Hale Waihona Puke Baidu时遗传 学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突 变鉴定，但实际上还有很多空白。 大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知 道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母， 所知更少，仅为30%。
二、实验确认基因功能
同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能 分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将 同源性研究的结果进一步外延。 如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难 的问题之一。 大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于 从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究 是远远不够的。 基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系 列反应。 传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因； 现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。 因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基 因相关的表型。