专题1基因工程_1[1].2基因工程的基本操作程序PPT幻灯片
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例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状， 说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃 后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
寻根问底：
（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的 生物体内提取不行吗？
提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一 的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方 式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转 录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但 如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序 列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这 种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生 物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到 一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
寻根问底：
1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器 功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若 要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网 和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在 于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大 肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
基 因
质粒
工
程
的
基
重组DNA
本
操
限制酶
作
程
序
目的基因
DNA连接酶
陕 西 师 大 附 中
（一）构建目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下 一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
（二）构建零件及其作用
1. 目的基因 2. 启动子 RNA聚合酶识别和 结合的一段特殊结构的DNA片段， 位于基因的首端，RNA聚合酶与 之结合才能驱动基因转录出 mRNA，进而获得需要的蛋白质。
导入受体细胞的方法 主要 是借鉴细菌或病毒侵染细胞的 途径，且因受体细胞的不同而不同。
（一）导入植物细胞
1.农杆菌转化法 （适用于双子叶植物和裸子植物）
2.其他方法（见教材P12“生物技术资料卡”）
（1）基因枪法 适用于单子叶植物 （2）花粉管通道法
（二）导入动物细胞
含目的基因 显微 的表达载体 注射
用同位素标记的 目的基因片段杂交
显出 杂交带
（表明目的基因已转录出了mRNA）
检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测 mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。
3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交技术
提取受体生 物的蛋白质
与相应抗体杂交 显 出 杂交带
（表明目的基因已形成蛋白质产品）
（二）个体水平
2. 过程
高温变性 （90~95℃）
低温退火 （55~60℃）
多次 重复
中温延伸 （70~75℃）
3.特点：指数形式扩增
双链DNA是在高温条件 下解链为单链DNA的，因此 整个过程不需要解旋酶。
（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷 酸序列已知时，可采用此种方法。
寻根问底：
将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果 这么做，结果会怎样？
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中 的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物， 没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也 无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来 讲不算基因工程。
蛋白质的氨 推
mRAN 推 基因DNA的 合
基酸顺序 测 核苷酸序列 测 核苷酸序列 成
目的 基因
DNA合成仪
二、基因表达载体的构建
用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的 基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的 黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重 组DNA分子，即基因表达载体。
2. 部分基因文库
受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称 为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。
（二）利用PCR技术扩增目的基因
1. 原理
PCR是聚合酶链式反应,它是利用DNA 双 链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加
以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个
过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩 增技术。
3. 终止子 一段特殊结构 的DNA片段，位于基因的尾 端，作用是使转录在所需要 的地方停止。
4. 标记基因 鉴别受体细 胞中是否含有目的基因，从 而将含有目的基因的细胞筛 选出来。
三、将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和 表达的过程称为转化。
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土 壤农杆菌和动植物细胞等。
常用的检测手段主要从分子水平和个体水平 进行。
（一）分子水平
分子杂交技术
1. 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
提取受体生 物全部DNA
适当限制 酶切割
用同位素标记的
DNA片段
目的基因片段杂交
显出 杂交带
（表明目的基因已插入）
2. 检测目的基因是否转录出了mRNA
提取受体生 物的mRNA
动物的 受精卵
显微注射技术
早期 胚胎
移植
分裂 含目的基因 分化 的受精卵
雌性动物输 发 卵管或子宫 育
转基百度文库 动物
问题
为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是 受精卵？
（三）导入微生物细胞
1. 过程
Ca2+ 处理法
（1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使
细菌易于接受外源DNA分子。
（2）重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。
2. 优点
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作 简单、价格低廉。
3. 常用受体细胞
大肠杆菌（E.coli）
四、目的基因的检测与鉴定
目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中， 是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达， 只有通过检测、鉴定才能得知。
基因工程的基本操作程序
第一步 第二步
获取目的基因 构建表达载体
第三步
导入受体细胞
第四步
目的基因检测与鉴定
一、目的基因的获取
（一）从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌 的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的 基因，称为基因文库。
1. 基因组文库
受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体 称为这种生物的基因组文库。
寻根问底：
寻根问底：
（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的 生物体内提取不行吗？
提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一 的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方 式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转 录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但 如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序 列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这 种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生 物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到 一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
寻根问底：
1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器 功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若 要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？
有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网 和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在 于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大 肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
基 因
质粒
工
程
的
基
重组DNA
本
操
限制酶
作
程
序
目的基因
DNA连接酶
陕 西 师 大 附 中
（一）构建目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下 一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
（二）构建零件及其作用
1. 目的基因 2. 启动子 RNA聚合酶识别和 结合的一段特殊结构的DNA片段， 位于基因的首端，RNA聚合酶与 之结合才能驱动基因转录出 mRNA，进而获得需要的蛋白质。
导入受体细胞的方法 主要 是借鉴细菌或病毒侵染细胞的 途径，且因受体细胞的不同而不同。
（一）导入植物细胞
1.农杆菌转化法 （适用于双子叶植物和裸子植物）
2.其他方法（见教材P12“生物技术资料卡”）
（1）基因枪法 适用于单子叶植物 （2）花粉管通道法
（二）导入动物细胞
含目的基因 显微 的表达载体 注射
用同位素标记的 目的基因片段杂交
显出 杂交带
（表明目的基因已转录出了mRNA）
检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测 mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。
3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交技术
提取受体生 物的蛋白质
与相应抗体杂交 显 出 杂交带
（表明目的基因已形成蛋白质产品）
（二）个体水平
2. 过程
高温变性 （90~95℃）
低温退火 （55~60℃）
多次 重复
中温延伸 （70~75℃）
3.特点：指数形式扩增
双链DNA是在高温条件 下解链为单链DNA的，因此 整个过程不需要解旋酶。
（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷 酸序列已知时，可采用此种方法。
寻根问底：
将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果 这么做，结果会怎样？
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中 的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物， 没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也 无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来 讲不算基因工程。
蛋白质的氨 推
mRAN 推 基因DNA的 合
基酸顺序 测 核苷酸序列 测 核苷酸序列 成
目的 基因
DNA合成仪
二、基因表达载体的构建
用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的 基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的 黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重 组DNA分子，即基因表达载体。
2. 部分基因文库
受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称 为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。
（二）利用PCR技术扩增目的基因
1. 原理
PCR是聚合酶链式反应,它是利用DNA 双 链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加
以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个
过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩 增技术。
3. 终止子 一段特殊结构 的DNA片段，位于基因的尾 端，作用是使转录在所需要 的地方停止。
4. 标记基因 鉴别受体细 胞中是否含有目的基因，从 而将含有目的基因的细胞筛 选出来。
三、将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和 表达的过程称为转化。
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土 壤农杆菌和动植物细胞等。
常用的检测手段主要从分子水平和个体水平 进行。
（一）分子水平
分子杂交技术
1. 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
提取受体生 物全部DNA
适当限制 酶切割
用同位素标记的
DNA片段
目的基因片段杂交
显出 杂交带
（表明目的基因已插入）
2. 检测目的基因是否转录出了mRNA
提取受体生 物的mRNA
动物的 受精卵
显微注射技术
早期 胚胎
移植
分裂 含目的基因 分化 的受精卵
雌性动物输 发 卵管或子宫 育
转基百度文库 动物
问题
为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是 受精卵？
（三）导入微生物细胞
1. 过程
Ca2+ 处理法
（1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使
细菌易于接受外源DNA分子。
（2）重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。
2. 优点
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作 简单、价格低廉。
3. 常用受体细胞
大肠杆菌（E.coli）
四、目的基因的检测与鉴定
目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中， 是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达， 只有通过检测、鉴定才能得知。
基因工程的基本操作程序
第一步 第二步
获取目的基因 构建表达载体
第三步
导入受体细胞
第四步
目的基因检测与鉴定
一、目的基因的获取
（一）从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌 的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的 基因，称为基因文库。
1. 基因组文库
受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体 称为这种生物的基因组文库。
寻根问底：