猪瘟诊断技术研究进展

猪瘟诊断技术研究进展

刘雪洋指导老师苏战强

摘要：猪瘟严重危害养猪业的健康发展，国内外对猪瘟的诊断方法做了大量研究。文章从血清学诊断和分子生物学诊断方法两大方面进行了回顾，并对诊断方法的发展方向做了展望。

关键词：猪瘟；诊断技术

Abstract: The classical swine fever serious harm to the healthy development of the pig industry, a lot of research diagnosis of swine fever at home and abroad. From the two major aspects of the serological diagnosis and molecular biology diagnostic methods were reviewed, and the direction of development of diagnostic methods are put forward.

Keywords: classical swine fever; diagnostic techniques

前言：猪瘟（Classical swine fever，CSF）是严重危害养猪业的主要传染病之一，国际动物卫生组织（OIE）将其确定为A类传染病，也是我国农业部规定的出入境检疫的一类传染病。猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），另外两个成员是牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）和羊边界病病毒（Border disease virus，BDV）[1]。这3种病毒感染均造成重大的经济损失。

我国在1954年就成功研制出了世界公认有良好免疫效果的猪瘟兔化弱毒疫苗，至今已应用了半个世纪，对我国以及引进兔化弱毒苗的国家的猪瘟疫情控制做出了积极贡献，并得到了高度评价，至今我国没有出现大面积猪瘟疫情暴发。但近年来，原已宣布消灭了猪瘟的一些欧洲国家又报道有猪瘟发生，我国猪瘟的发病率亦呈上升趋势，而且自然病例中常见非典型、温和型或亚急性症状CSFV 持续性感染，妊娠母猪带毒综合征以及新生仔猪的免疫耐受等，严重威胁着我国养猪业的发展[2]，针对猪瘟流行的新特点，对猪瘟的诊断检测技术要求越来越高，本文就现在的猪瘟诊断技术进行综述。

1 血清学诊断方法

1.1 琼脂扩散试验(AGP)

琼脂扩散试验是用来检测抗原或抗体的经典实验方法。Molnar建立了琼脂扩散沉淀法，可用病猪脾、淋巴结做抗原进行检测。琼扩试验操作简单，不需特殊仪器，费用低。但特异性和敏感性差，现在猪瘟的诊断一般不采用此方法。

1.2 荧光抗体试验（FAT）

猪瘟荧光抗体检测猪瘟病毒是一种灵敏而又特异的诊断方法，许多国家和地区将冰冻组织切片或触片的直接荧光抗体试验作为猪瘟的法定诊断方法，OIE在《哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》中也指定FAT 为猪瘟诊断法定方法。可用FAT直接检测扁桃体、脾脏、肾脏和回肠远端冰冻切片中的抗原。也可将病猪扁桃体和脾混合匀浆后接种无瘟病毒污染的猪源细胞（如PK-15），24h～72h后进行飞片FAT试验，检查细胞中是否存在CSFV，这种方法比冰冻组织切片法更为敏感。

1.3间接血凝试验（IHA）

1.3.1正向间接血凝试验

正向间接血凝试验是利用CSFV致敏红细胞，将待检血清梯度稀释后进行抗原抗体反应，根据红细胞的凝集判断结果。此法能够测出猪瘟抗体效价，有简便易操作的特点。可用于免疫抗体的监测。刘杰标等[3](2002) 对广西宜州市和环江县共790份猪血清进行了猪瘟免疫抗体检测，结果表明两地的猪瘟免疫抗体效价较高，与实际免疫情况基本相符。但此方法的缺点是不能区分抗体水平是由于疫苗免疫还是野毒感染所引起。

1.3.2反向间接血凝试验

反向间接血凝试验则是用猪瘟免疫血清提取IgG，致敏绵羊红细胞，用之检测CSFV。此法能够检测组织病料如脾脏、淋巴结、扁桃体中的CSFV抗原。但由于对组织病料处理方法有差异，而且组织中的血细胞易造成干扰，非特异性凝集使得结果判定困难，因而现在已很少应用。

1.4中和试验

1.4.1兔体中和试验

将猪瘟病毒与待检血清中和后接种兔体，观察体温变化曲线。当待检血清稀

释度大于1∶32时，则表明待检血清能够保护猪群免受CSFV感染；当待检血清稀释度小于1∶32时；应当对猪群进行免疫接种。由于CSFV和BVDV同源性很高，在血清学上有交叉反应，因而血清要分别和CSFV、BVDV做中和试验，如果CSFV 抗体效价高，则可能是感CSFV。但要明确区分CSFV、BVDV还需用单克隆抗体技术和核酸探针技术加以区别。

1.4.2荧光抗体病毒中和试验（FAVN）

此法是国际贸易指定方法。飞片培养PK-15细胞，将待检血清56℃30min 灭活后做适当稀释，与等体积的200TCID

/0.1ml的病毒液2h。最后接入飞片上

50

吸附1h，然后加入维持液孵育2d以上。采用直接免疫荧光方法进行荧光观察，并设立对照组。可发现对照组有翠绿色光斑，而试验组光斑消失。其优点特异性强，操作简便，不足之处是仅能定性，不能定量。

1.4.3过氧化物酶联中和试验(NPLA)

/50μL 此法也是国际贸易指定方法。 NPLA是将待检血清稀释后与200TCID

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的病毒液混合培养一定时间后接入细胞，待细胞长成单层后固定，加入高免猪抗CSFV血清，最后加入辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG(IgG-HRPO)，作用后加入底物现色，根据颜色就可以判定结果。NPLA的优点在于无需飞片，对结果可通过肉眼进行判定。

1.5酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA免疫检测技术应用很广，发展很快，是检测抗体的主要免疫学方法，也是监测猪群抗体水平的主要技术手段，常用于规模化养猪场的监测。根据ELISA的基本原理，发展出了间接ELISA、Dot-ELISA、微波快速ELISA、竞争ELISA 以及抗原捕获ELISA。

间接ELISA是用CSFV已知抗原包板，待检血清稀释后加入孔中，反应后加入HRPO标记的葡萄球菌蛋白A（PPA）或其他可与抗体结合物质，作用后加入底物显色，酶标仪读数后判定结果。周宗安等[4]应用PPA-ELISA测定接种兔化弱毒疫苗猪体的抗体水平，并与兔体中和试验进行比较，肯定了该法在CSF免疫监测中的作用。杨晓梅等[5]也应用此法检测规模化猪场的猪瘟抗体，取得了满意结果。但是由于抗血清为多克隆抗体，无法区别疫苗免疫产生的抗体与CSFV野毒自然感染产生的抗体。Dot-ELISA原理与ELISA相同，只不过将固相载体换为混