第3章生物技术制药
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2013-6-6 苏州大学 4
利用基因工程技术生产药品的优点：
4. 内源性生理活性物质在作为药物使用 时存在的不足之处，可通过基因工程 和蛋白质工程进行改造和去除。 5. 利用基因工程技术可获得新型化合物， 扩大药物筛选来源。
2013-6-6
苏州大学
5
第二节 基因工程药物生产的基本过程
1. 基因工程技术：将目的基因插入载体，拼接后 转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞）， 实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。 2. 基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的 克隆，构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿 主菌构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表 达产物的分离纯化，产品的检验等。
2013-6-6
苏州大学
21
4、cDNA克隆
pUC及gt11为表达型载体，在cDNA插入 位置的上游具有启动基因顺序；而pBR322 及gt10为非表达型载体。在cDNA克隆操 作中应该根据不同的需要选择适当的载体。 cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体， 如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。 选用表达型载体可以增加目的基因的筛选 方法，有利于目的基因的筛选。
2013-6-6
苏州大学
8
一、工程菌（或细胞）构建中重要的工具
1.工具酶：限制性内切酶和连接酶 2.基因：对目的基因DNA进行序列分析。 3.表达系统： 原核生物和真核生物两类表达系统； 选择基因表达的系统主要考虑的是保证表 达蛋白质的功能， 其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化 的难易。
cDNA克隆示意图
mRNA
逆转录酶
ss-DNA DNA多聚酶I Klenow片段 逆转录酶
ds-cDNA
ds-cDNA
2013-6-6 苏州大学 13
1、mRNA的纯化
分离纯化目的基因的mRNA极其困难； mRNA占细胞内总RNA总量的2%~5%，易降 解； mRNA特点：在真核细胞中mRNA的3‘末端 常常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长 达20~250个腺苷酸； 分离办法：可采用Oligo dT-纤维素，以亲和 层析法。洗脱方法是高浓度盐溶液使mRNA 特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液和蒸馏水 将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的 mRNA。
2013-6-6 苏州大学 22
cDNA文库
R. Young和R. Davis设计的gt10和gt11是噬菌 体克隆载体，可用于构建cDNA文库。一方面它 们具有较高的克隆效率，1ng cDNA可产生5000 个克隆，另一方面又可容纳较大分子量的外源 DNA片段。 因为筛选噬菌斑在技术操作上较筛选细菌菌落更 方便，因此gt10和gt11类载体在构建文库时优 于质粒载体pBR322。
2013-6-6 苏州大学 14
2、cDNA第一链的合成
① 一般mRNA都带有3‘-polyA，所以 可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶 的催化下，开始cDNA链的合成。 一次好的逆转录反应可使寡聚dT选 出的mRNA有5%~30%被拷贝。
2013-6-6
苏州大学
15
3、cDNA第二链的合成
② 碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNAmRNA杂交链中的mRNA链； ③ 以cDNA第一链为模板合成第二链。由于 第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发 夹形结构，所以，可以从这一点开始合 成cDNA第二链。此反应是在DNA聚合酶 I催化下完成的。 ④ 核酸酶S1专一性切除单链DNA（发夹结 构），变性琼脂糖凝胶电泳检测双链 cDNA分子的大小。
2013-6-6 苏州大学 9
二、下游阶段在产业化中是极其重要的
1、下游阶段总目标：是将实验室成果产业 化、商品化。 2、下游阶段主要工作：
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦
2013-6-6
工程菌大规模发酵最佳参数的确立， 新型生物反应器的研制， 高效分离介质及装置的开发， 分离纯化的优化控制， 高纯度产品的制备技术， 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造， 电子计算机的优化控制等。
2013-6-6 苏州大学 25
cDNA片段与载体的连接
（1）、加同聚尾连接： （2）、加人工接头连接：为了保护 cDNA不受限制酶破坏，可在加接 头前用甲基化酶修饰这些限制酶切 位点。
2013-6-6
苏州大学
26
5、将重组体导入宿主细胞
体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌 形成噬菌斑； 转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。
第三章 基因工程制药
2013-6-6
苏州大学
1
第一节 概述
生物技术的核心就是基因工程，基因工程 技术最成功的应用就是用于生物治疗的新 型生物药物的研制。 传统生物药物由于来源及制备上的困难、 价格等因素的影响，此外在制备过程可能 受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等 问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可 靠的新方法来制备生物药物。
2013-6-6
苏州大学
29
分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必 须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进 行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定 位、基因测序以及确定基因的转录方向、 转录起始点等。 1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广 泛的应用。
2013-6-6
苏州大学
30
二、化学合成法
5 RNaesH AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ DNApol dNTPs AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ S 5’ 3’ 1
苏州大学
5’
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ T4-DNA ligase TTTTTTTTTTTTTT 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 19
2013-6-6
苏州大学
27
6、cDNA文库的鉴定
（1）根据重组体的表型进行筛选： 抗性基因失活法 菌落或噬菌斑颜色改变法 凝胶电泳 分子杂交 DNA序列分析测定
2013-6-6
苏州大学
28
7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆， 主要采用： （1）核酸探针杂交法： （2）免疫反应鉴定法
2013-6-6 苏州大学 2
应用基因工程技术可十分方便且有效地解 决上述提到的问题，从量、质上都可以得 到改进，且可以创造全新物质。 癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分 泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基 因工程技术获得。
2013-6-6
苏州大学
3
利用基因工程技术生产药品的优点：
1. 可以大量生产生理活性蛋白和多肽 （如胰岛素、干扰素、细胞因子等）， 为临床使用提供有效的保障； 2. 可以提供足够数量的生理活性物质， 以便对其生理、生化和结构进行深入 的研究，从而扩大这些物质的应用范 围； 3. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更 多的内源性生理活性物质；
苏州大学 10
第三节 目的基因的获得
2013源自文库6-6
苏州大学
11
第三节 目的基因的获得
一、逆转录法 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
2013-6-6 苏州大学 12
2013-6-6 苏州大学 16
cDNA法克隆目的基因的基本战略
cDNA第一链的合成
mRNA
G 5‘ppp’ G 5 G 5‘ppp’ G 5 逆转录酶 dNTPs 引物 退火 AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ AAAAAAAAAAAAAAOH TTTTTTTTTTTTTTp 3’
5’
G 5‘ppp’ G 5 cDNA第一链
2013-6-6
苏州大学
24
gt11载体
蛋白质表达的cDNA克隆载体； 宿主菌是大肠杆菌Y1090； gt11中cDNA插入片段是克隆在lacZ的羧基 端，可表达成半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白， 带cDNA插入片段的gt11可形成清晰的无 色噬菌斑； 未带cDNA插入片段的gt11则形成蓝色噬 菌斑。
5’
3’ Klenow
dNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
S1
TTTTTTTTTTTTTT
2013-6-6 苏州大学
AAAAAAAAAAAAAA
18
cDNA第二链的合成
置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 5‘ppp’ G G
T4-DNA连接酶连接
2013-6-6
克隆入合适的载体
苏州大学
32
化学合成法的基本战略
全基因合成
补钉延长法：
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长
的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
混合退火 Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
2013-6-6 苏州大学 33
2013-6-6
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’ G
3‘ 5H O G 5‘ppp’ G 3‘ HOCCCCCCC 5 NaOH 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH TTTTTp 5’ 3’ AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’
化学合成法的基本战略
全基因合成
大片段酶促法：
根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
混合退火
Klenow酶聚合
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
2013-6-6 苏州大学 34
第四节 基因表达
需重点考虑的问题： 目的基因的表达量， 表达产物的稳定性， 产物的生物学活性， 表达产物的分离纯化。 在进行基因表达设计时，需综合考虑 各种影响因素以建立最佳基因表达体 系。
2013-6-6 苏州大学
AAAAAAAAAAAAAAOH TTTTTTTTTTTTTTp 3’
5’
17
cDNA第二链的合成
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失
G
5‘ppG p’5 NaOH
OH
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 煮沸 5’
TTTTTTTTTTTTTTp
退火
5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ Klenow
苏州大学
dNTPs
3‘ HOCCCCCCC 2013-6-6 5‘ pGGGGGGG
TTTTTp 5’ AAAAAOH
20
4、cDNA克隆
① 两类用于cDNA克隆的载体： 载体DNA来源： 质粒DNA（如pUC、pBR322等） 噬菌体DNA（如gt10、 gt11等） 是否表达： 表达型 非表达型载体
2013-6-6 苏州大学 35
一、宿主细胞的选择
1、作为宿主细胞的条件： 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低，需氧低， 适当的发酵温度和细胞形态， 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高，产物容易提取纯 化。
2013-6-6 苏州大学 6
基因工程药物制备的一般过程
获得目的基因 组建重组质粒 工程菌或细胞 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定
成品检定
包装
2013-6-6 苏州大学 7
3.基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌 （或细胞）构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成； 下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的 大规模培养一直到产品的分离纯化、质量 控制等。
2013-6-6 苏州大学 23
gt10载体
cDNA插入到gt10中可使噬菌体阻遏物基因（cI） 失活。 当用大肠杆菌c600的突变型hflA（高频溶原性） 作为宿主时，只有携带cDNA插入片段的噬菌体 可形成噬菌斑； 而在非突变型大肠杆菌c600宿主菌中，带与不带 cDNA插入片段的噬菌体都可形成噬菌斑。
人工化学合成的限制： 不能合成太长的基因，50~60bp； 是人工合成时，遗传密码的简并性可导致 中性突变； 是费用较高。
2013-6-6
苏州大学
31
化学合成法的基本战略 全基因合成
化学合成目的基因有三种战略：
小片段粘接法：
根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链 DNA小片段 混合退火
利用基因工程技术生产药品的优点：
4. 内源性生理活性物质在作为药物使用 时存在的不足之处，可通过基因工程 和蛋白质工程进行改造和去除。 5. 利用基因工程技术可获得新型化合物， 扩大药物筛选来源。
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5
第二节 基因工程药物生产的基本过程
1. 基因工程技术：将目的基因插入载体，拼接后 转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞）， 实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。 2. 基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的 克隆，构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿 主菌构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表 达产物的分离纯化，产品的检验等。
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4、cDNA克隆
pUC及gt11为表达型载体，在cDNA插入 位置的上游具有启动基因顺序；而pBR322 及gt10为非表达型载体。在cDNA克隆操 作中应该根据不同的需要选择适当的载体。 cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体， 如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。 选用表达型载体可以增加目的基因的筛选 方法，有利于目的基因的筛选。
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一、工程菌（或细胞）构建中重要的工具
1.工具酶：限制性内切酶和连接酶 2.基因：对目的基因DNA进行序列分析。 3.表达系统： 原核生物和真核生物两类表达系统； 选择基因表达的系统主要考虑的是保证表 达蛋白质的功能， 其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化 的难易。
cDNA克隆示意图
mRNA
逆转录酶
ss-DNA DNA多聚酶I Klenow片段 逆转录酶
ds-cDNA
ds-cDNA
2013-6-6 苏州大学 13
1、mRNA的纯化
分离纯化目的基因的mRNA极其困难； mRNA占细胞内总RNA总量的2%~5%，易降 解； mRNA特点：在真核细胞中mRNA的3‘末端 常常含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，长 达20~250个腺苷酸； 分离办法：可采用Oligo dT-纤维素，以亲和 层析法。洗脱方法是高浓度盐溶液使mRNA 特异结合于寡聚dT，再以低盐溶液和蒸馏水 将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的 mRNA。
2013-6-6 苏州大学 22
cDNA文库
R. Young和R. Davis设计的gt10和gt11是噬菌 体克隆载体，可用于构建cDNA文库。一方面它 们具有较高的克隆效率，1ng cDNA可产生5000 个克隆，另一方面又可容纳较大分子量的外源 DNA片段。 因为筛选噬菌斑在技术操作上较筛选细菌菌落更 方便，因此gt10和gt11类载体在构建文库时优 于质粒载体pBR322。
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2、cDNA第一链的合成
① 一般mRNA都带有3‘-polyA，所以 可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶 的催化下，开始cDNA链的合成。 一次好的逆转录反应可使寡聚dT选 出的mRNA有5%~30%被拷贝。
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3、cDNA第二链的合成
② 碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNAmRNA杂交链中的mRNA链； ③ 以cDNA第一链为模板合成第二链。由于 第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发 夹形结构，所以，可以从这一点开始合 成cDNA第二链。此反应是在DNA聚合酶 I催化下完成的。 ④ 核酸酶S1专一性切除单链DNA（发夹结 构），变性琼脂糖凝胶电泳检测双链 cDNA分子的大小。
2013-6-6 苏州大学 9
二、下游阶段在产业化中是极其重要的
1、下游阶段总目标：是将实验室成果产业 化、商品化。 2、下游阶段主要工作：
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦
2013-6-6
工程菌大规模发酵最佳参数的确立， 新型生物反应器的研制， 高效分离介质及装置的开发， 分离纯化的优化控制， 高纯度产品的制备技术， 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造， 电子计算机的优化控制等。
2013-6-6 苏州大学 25
cDNA片段与载体的连接
（1）、加同聚尾连接： （2）、加人工接头连接：为了保护 cDNA不受限制酶破坏，可在加接 头前用甲基化酶修饰这些限制酶切 位点。
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5、将重组体导入宿主细胞
体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌 形成噬菌斑； 转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。
第三章 基因工程制药
2013-6-6
苏州大学
1
第一节 概述
生物技术的核心就是基因工程，基因工程 技术最成功的应用就是用于生物治疗的新 型生物药物的研制。 传统生物药物由于来源及制备上的困难、 价格等因素的影响，此外在制备过程可能 受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等 问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可 靠的新方法来制备生物药物。
2013-6-6
苏州大学
29
分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必 须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进 行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定 位、基因测序以及确定基因的转录方向、 转录起始点等。 1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广 泛的应用。
2013-6-6
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30
二、化学合成法
5 RNaesH AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ DNApol dNTPs AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ S 5’ 3’ 1
苏州大学
5’
5’
TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ T4-DNA ligase TTTTTTTTTTTTTT 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 19
2013-6-6
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6、cDNA文库的鉴定
（1）根据重组体的表型进行筛选： 抗性基因失活法 菌落或噬菌斑颜色改变法 凝胶电泳 分子杂交 DNA序列分析测定
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7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆， 主要采用： （1）核酸探针杂交法： （2）免疫反应鉴定法
2013-6-6 苏州大学 2
应用基因工程技术可十分方便且有效地解 决上述提到的问题，从量、质上都可以得 到改进，且可以创造全新物质。 癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分 泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基 因工程技术获得。
2013-6-6
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利用基因工程技术生产药品的优点：
1. 可以大量生产生理活性蛋白和多肽 （如胰岛素、干扰素、细胞因子等）， 为临床使用提供有效的保障； 2. 可以提供足够数量的生理活性物质， 以便对其生理、生化和结构进行深入 的研究，从而扩大这些物质的应用范 围； 3. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更 多的内源性生理活性物质；
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第三节 目的基因的获得
2013源自文库6-6
苏州大学
11
第三节 目的基因的获得
一、逆转录法 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
2013-6-6 苏州大学 12
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cDNA法克隆目的基因的基本战略
cDNA第一链的合成
mRNA
G 5‘ppp’ G 5 G 5‘ppp’ G 5 逆转录酶 dNTPs 引物 退火 AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ AAAAAAAAAAAAAAOH TTTTTTTTTTTTTTp 3’
5’
G 5‘ppp’ G 5 cDNA第一链
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gt11载体
蛋白质表达的cDNA克隆载体； 宿主菌是大肠杆菌Y1090； gt11中cDNA插入片段是克隆在lacZ的羧基 端，可表达成半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白， 带cDNA插入片段的gt11可形成清晰的无 色噬菌斑； 未带cDNA插入片段的gt11则形成蓝色噬 菌斑。
5’
3’ Klenow
dNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
S1
TTTTTTTTTTTTTT
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AAAAAAAAAAAAAA
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cDNA第二链的合成
置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 5‘ppp’ G G
T4-DNA连接酶连接
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克隆入合适的载体
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32
化学合成法的基本战略
全基因合成
补钉延长法：
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长
的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
混合退火 Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
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cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’ G
3‘ 5H O G 5‘ppp’ G 3‘ HOCCCCCCC 5 NaOH 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH TTTTTp 5’ 3’ AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’
化学合成法的基本战略
全基因合成
大片段酶促法：
根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
混合退火
Klenow酶聚合
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
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第四节 基因表达
需重点考虑的问题： 目的基因的表达量， 表达产物的稳定性， 产物的生物学活性， 表达产物的分离纯化。 在进行基因表达设计时，需综合考虑 各种影响因素以建立最佳基因表达体 系。
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AAAAAAAAAAAAAAOH TTTTTTTTTTTTTTp 3’
5’
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cDNA第二链的合成
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失
G
5‘ppG p’5 NaOH
OH
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp 煮沸 5’
TTTTTTTTTTTTTTp
退火
5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ Klenow
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dNTPs
3‘ HOCCCCCCC 2013-6-6 5‘ pGGGGGGG
TTTTTp 5’ AAAAAOH
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4、cDNA克隆
① 两类用于cDNA克隆的载体： 载体DNA来源： 质粒DNA（如pUC、pBR322等） 噬菌体DNA（如gt10、 gt11等） 是否表达： 表达型 非表达型载体
2013-6-6 苏州大学 35
一、宿主细胞的选择
1、作为宿主细胞的条件： 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低，需氧低， 适当的发酵温度和细胞形态， 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高，产物容易提取纯 化。
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基因工程药物制备的一般过程
获得目的基因 组建重组质粒 工程菌或细胞 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定
成品检定
包装
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3.基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌 （或细胞）构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成； 下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的 大规模培养一直到产品的分离纯化、质量 控制等。
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gt10载体
cDNA插入到gt10中可使噬菌体阻遏物基因（cI） 失活。 当用大肠杆菌c600的突变型hflA（高频溶原性） 作为宿主时，只有携带cDNA插入片段的噬菌体 可形成噬菌斑； 而在非突变型大肠杆菌c600宿主菌中，带与不带 cDNA插入片段的噬菌体都可形成噬菌斑。
人工化学合成的限制： 不能合成太长的基因，50~60bp； 是人工合成时，遗传密码的简并性可导致 中性突变； 是费用较高。
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化学合成法的基本战略 全基因合成
化学合成目的基因有三种战略：
小片段粘接法：
根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链 DNA小片段 混合退火