金银花叶中木犀草素的分离与鉴定
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[ 5 ] 王祥培 ,万德光 ,裴 瑾 ,等. 头花蓼和头状蓼的 HPLC指纹图谱鉴 定研究 [ J ]. 天然产物研究与开发 , 2007, 19: 253.
[ 6 ] 刘 圆 ,彭镰心 ,刘 超 ,等. 木香 、川木香 、土木香的高效液相色谱 指纹图谱鉴别 [ J ]. 药物分析杂志 , 2006, 26 ( l1) : 1574.
2. 3 聚酰胺柱的装填 把一定量的聚酰胺用水浸泡 24 h,湿法装 柱 ,然后用甲醇以 3 BV / h的流速洗涤聚酰胺 ,至流出液澄清为 至 ,再用蒸馏水洗至无甲醇 。 2. 4 木犀草素产品的分离纯化 样品上柱后开始洗脱 ,先用水洗 去糖 、蛋白分子及其它水溶性杂质 ,然后采用 30% , 50% , 70%的 醇溶液梯度洗脱 ,采用 30%和 50%的醇梯度洗脱时 ,柱中开始有 淡粉色和黄色色带出现 ,随着洗脱的进行 ,淡粉色色带变得模糊 , 黄色色带 开 始缓 慢 下 移 。当 两 个 色 带 拉 开 一 段 距 离 后 , 改 用 70%的醇洗脱 ,黄色色带下移的速度加快 ,收集此色带从开始到 流完的洗脱液 ,每 50 m l一接 ,记为 1～9瓶 。
S2 0. 816 1. 000 0. 896 0. 954 0. 954 0. 816
S3 0. 831 0. 896 1. 000 0. 929 0. 929 0. 877
S4 0. 733 0. 954 0. 929 1. 000 0. 997 0. 806
S5 0. 741 0. 954 0. 929 0. 997 1. 000 0. 820
1100型高效液相色谱仪 ,红外光谱仪 FTIR - 8400S (日本岛津公 (和标准品的一致 ) ,只是峰增强了 。
司 ) ,紫外灯 。
聚酰胺粉 (80 - 100目 ) ,木犀草素标准品 (购于北京丰斯特
公司 ) ,工业酒精 ,其它试剂均为分析纯 。
2 方法
2. 1 木犀草素含量测定 精密吸取 0. 100 mg/m l木犀草素对照
金银花叶中木犀草素的分离与鉴定
王丽婷 1 , 王丽娟 2
(1. 宁夏大学政法学院 ,宁夏 银川 750021; 2. 宁夏回族自治区吴忠市人民医院 ,宁夏 银川 750002)
摘要 :目的 建立一种可以从金银花叶中分离出木犀草素的方法 。方法 采用超声提取 ,石油醚回流脱色 、大孔树脂柱和
聚酰胺柱分离相结合的方法 ,通过薄层色谱 、紫外光谱 、红外光谱 、高效液相色谱进行鉴定 ,最终得到木犀草素产品 。结 果 此产品纯度最高可达 81. 6% ,得率为 28. 9μg·g- 1。结论 建立了从金银花叶中分离木犀草素的新工艺 。
S10 0. 554 0. 689 1. 000 0. 649 0. 563
S11 0. 917 0. 750 0. 649 1. 000 0. 820
S12 0. 745 0. 735 0. 563 0. 820 1. 000
R
0. 442 0. 338 0. 397 0. 401 0. 471
S7 0. 381 0. 184 0. 363 0. 130 0. 148 0. 566 1. 000 0. 803 0. 763 0. 696 0. 879 0. 840 0. 393
图 1 产品色谱图
直线回归方程为 Y = 33 578. 22C - 11. 807 ( Y代表峰面积 , C代表
木犀草素浓度 mg /m l) , R2 = 0. 999 7;木犀草素在 0. 02～0. 1 mg / m l范围内呈良好的线性关系 。
2. 2 上柱样品的制备 用 20倍量的 50% 乙醇超声浸提黄酮后 ,
样品
S8
S9
S10
S11
S12
S1
0. 483 0. 410 0. 343 0. 396 0. 545
S2
0. 222 0. 129 0. 223 0. 191 0. 280
S3
0. 469 0. 283 0. 368 0. 372 0. 410
S4
0. 167 0. 115 0. 217 0. 139 0. 207
品溶液 2. 0, 4. 0, 6. 0, 8. 0, 10. 0 m l于 10 m l容量瓶中 ,用流动相
(甲醇 : 0. 02%磷酸 = 50 : 50)定容至刻度 ,选择色谱柱为 ZOR2
BAXSB - C18柱 ( 250 mm ×4. 6 mm , 5 μm , Agilent公司 ) ;以甲醇 : 0. 02%磷 酸 = 50 ∶50 为 流 动 相 ; 在 检 测 波 长 350 nm , 柱 温 30℃;流速为 1. 0 m l/m in的条件下进样 20. 0μl。记录峰面积 ,得
关键词 :金银花叶 ; 木犀草素 ; 分离 ; 鉴定 DO I标识 : doi: 10. 3969 / j. issn. 100820805. 2010. 11. 110 中图分类号 : R284. 2 文献标识码 : B 文章编号 : 100820805 (2010) 1122947203
S6 0. 746 0. 816 0. 877 0. 806 0. 820 1. 000
S7 0. 381 0. 184 0. 363 0. 130 0. 148 0. 566
S8 0. 483 0. 222 0. 469 0. 167 0. 185 0. 514
S9 0. 410 0. 129 0. 283 0. 115 0. 121 0. 369
色谱条件的优化 在色谱条件优化过程中 ,流动相分别比较 了甲醇 - 水 、甲醇 - 磷酸水 、乙腈 - 水 ,最后选择了乙腈 - 水进行
梯度洗脱 ,因千斤拔组分 k分’ 布区域较广 ,因此采用曲线梯度洗 脱 。柱温分别考察了 25, 30, 35 ℃,流速分别考察了 0. 8, 1, 1. 2 m l/m in,最后发现柱温 、流速对色谱行为影响不大 ,综合考虑 ,最 后选择柱温为 30 ℃,流速为 1 m l/m in。选择波长时 ,参考 3D 色 谱图进行选择 ,并提取不同波长通道进行比较 ,最后确定 274 nm 时色谱图峰较多 ,丰度较好 ,不同波长的色谱图比较见图 1 ( b) 。
[ 2 ] 宋立人 ,洪 恂 ,丁续亮 ,等. 中国中药学大辞典 (上 ) [M ]. 北京 :人 民卫生出版社 , 2001: 195.
[ 3 ] 饶伟文 ,黄建楷 ,温志芳 ,等. 千斤拔的品种调查与质量研究 [ J ]. 中 草药. 1999, 30 ( 3) : 219.
[ 4 ] 周 颖 ,王 彦 ,王刃锋. 半边莲药材 HPLC指纹图谱的研究 [ J ]. 中成药 , 2007, 29 ( l2) : 1717.
L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2010 VOL . 21 NO. 11
时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期
表 3 12批样品的相似度计算结果
样品 S1
源自文库S2
S3
S4
S5
S6
S1 1. 000 0. 816 0. 831 0. 733 0. 741 0. 746
图 2 产品加标后色谱图
倍柱体积的蒸馏水洗掉蛋白和糖类等大分子杂质 ,再用 70%的
由以上色谱峰可见 ,此类产品中木犀草素的纯度较高 。
乙醇以最大流速洗脱 ,收集 2～8倍柱体积的洗脱液 ,浓缩后得到 3. 1. 3 紫外图谱法 采用标准品木犀草素 (结构如图 3)和样品
样品 。
对照的方法进行紫外图谱 [3 ]鉴定 。使用的移动剂为无水醋酸钠
将提取液浓缩 ,然后按照质量比 (金银花叶和聚酰胺粉的质量 )
为 15∶1的比例混入聚酰胺 ( 80 ～100 目 )粉 ,使其保持松散 ,不
结块 ,将此固体粉末取出 ,放在索氏提取器中用石油醚回流脱色
10次后 ,取出此固体粉末 ,挥干石油醚 ,即得黄酮粗品拌料 ,然后
经过物料比 (黄酮粗品拌料与大孔树脂质量比 )为 1 ∶6,柱径与 柱长比为 1∶6的 HPD100型大孔树脂柱进一步分离富集 ,先用 2
待收集更多确定品种和来源的样品后 ,可建立大叶千斤拔 、 蔓性千斤拔的判别函数 ,用以确定未知样品的归属 ,或建立人工 神经网络模型 ,以更好地区分两种千斤拔 ,更好的应用于中成药 的质量标准控制 。本文所建方法简便 ,灵敏 ,为两种千斤拔的鉴 别提供了新的方法 。
参考文献 :
[ 1 ] 国家药典委员会. 中国药典 , Ⅰ部 [ S ]. 北京 : 化学工业出版社 , 2005:附录 22.
R 0. 878 0. 950 0. 974 0. 942 0. 946 0. 858 0. 393 0. 442 0. 338 0. 397 0. 401 0. 471 1. 000
3 讨论 实验曾考察了氯仿 、醋酸乙酯 、甲醇为提取溶媒进行提取 ,考
察了冷浸提取 、超声提取 、冷浸后超声提取等方法 ,最后确定用甲 醇冷浸后超声提取 30 m in效果最好 ,且方法简便 。
金银花是名贵中药材 ,含有多种有效成分 ,木犀草素作为一 种黄酮单体 ,具有抗炎 、抗菌 、抗癌 、抑酶 、抗氧化 、利胆利尿等多 种作用 ,金银花叶作为金银花的一种副产物 ,产量较大 ,而且常常 被浪费掉 ,研究表明 ,金银花叶中木犀草素的含量平均是花中的
收稿日期 : 2009211223; 修订日期 : 2010203225 基金项目 :宁夏高等学校科研项目 ;宁夏大学基金项目 (No. LG0402) 作者简介 :王丽婷 (19822) ,女 (汉族 ) ,宁夏吴忠人 ,现任宁夏大学政法学 院讲师 ,硕士学位 ,主要从事天然产物研究工作.
比较二者色谱图 ,直观上很难看出两者的差异 ,因此必须从 量化指标对两者进行进一步比较 。从主成分投影图上可看出大 叶千斤拔 、蔓性千斤拔能较好的分开 。
本研究以 24个色谱峰为量化指标进行聚类分析 ,对每个样 品的主成分得分进行聚类分析 ,结果大叶千斤拔归为一类 ,蔓性 千斤拔归为一类 ,与预期目标一致 。待收集更多千斤拔样品后 , 作进一步比较 ,将会获得更多和更为准确的信息 。
2. 8倍 [1, 2 ] ,但目前对于金银花叶中木犀草素的研究仅限于含量 测定 ,对于木犀草素产品的分离 、纯化还未见报道 。本文采用超 声提取 ,石油醚回流脱色 、大孔树脂柱和聚酰胺柱分离相结合的 方法从金银花叶中分离出了黄酮单体木犀草素 ,并结合聚酰胺薄 层色谱 、红外光谱 、紫外光谱 、高效液相色谱等方法对分离后得到 的木犀草素产 品 进 行 定 性 鉴 定 和 定 量 分 析 , 其 纯 度 最 高 可 达 81. 6% ,得率为 28. 9μg·g- 1。 1 仪器与材料
紫外 - 可见分光光度计 UV - 2450 (日本岛津公司 ) ;电子分
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期
L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2010 VOL. 21 NO. 11
析天平 ;旋转蒸发器 RE - 52AA (上海亚荣生化仪器厂 ) ; Agilent 谱图如图 1～2,结果发现 ,产品加标后的色谱峰保留时间不变
S10 0. 343 0. 223 0. 368 0. 217 0. 212 0. 278
S11 0. 396 0. 191 0. 372 0. 139 0. 158 0. 387
S12 0. 545 0. 280 0. 410 0. 207 0. 221 0. 262
R 0. 878 0. 950 0. 974 0. 942 0. 946 0. 858
S5
0. 185 0. 121 0. 212 0. 158 0. 221
S6
0. 514 0. 369 0. 278 0. 387 0. 262
S7
0. 803 0. 763 0. 696 0. 879 0. 840
S8
1. 000 0. 623 0. 554 0. 917 0. 745
S9
0. 623 1. 000 0. 689 0. 750 0. 735
[ 6 ] 刘 圆 ,彭镰心 ,刘 超 ,等. 木香 、川木香 、土木香的高效液相色谱 指纹图谱鉴别 [ J ]. 药物分析杂志 , 2006, 26 ( l1) : 1574.
2. 3 聚酰胺柱的装填 把一定量的聚酰胺用水浸泡 24 h,湿法装 柱 ,然后用甲醇以 3 BV / h的流速洗涤聚酰胺 ,至流出液澄清为 至 ,再用蒸馏水洗至无甲醇 。 2. 4 木犀草素产品的分离纯化 样品上柱后开始洗脱 ,先用水洗 去糖 、蛋白分子及其它水溶性杂质 ,然后采用 30% , 50% , 70%的 醇溶液梯度洗脱 ,采用 30%和 50%的醇梯度洗脱时 ,柱中开始有 淡粉色和黄色色带出现 ,随着洗脱的进行 ,淡粉色色带变得模糊 , 黄色色带 开 始缓 慢 下 移 。当 两 个 色 带 拉 开 一 段 距 离 后 , 改 用 70%的醇洗脱 ,黄色色带下移的速度加快 ,收集此色带从开始到 流完的洗脱液 ,每 50 m l一接 ,记为 1～9瓶 。
S2 0. 816 1. 000 0. 896 0. 954 0. 954 0. 816
S3 0. 831 0. 896 1. 000 0. 929 0. 929 0. 877
S4 0. 733 0. 954 0. 929 1. 000 0. 997 0. 806
S5 0. 741 0. 954 0. 929 0. 997 1. 000 0. 820
1100型高效液相色谱仪 ,红外光谱仪 FTIR - 8400S (日本岛津公 (和标准品的一致 ) ,只是峰增强了 。
司 ) ,紫外灯 。
聚酰胺粉 (80 - 100目 ) ,木犀草素标准品 (购于北京丰斯特
公司 ) ,工业酒精 ,其它试剂均为分析纯 。
2 方法
2. 1 木犀草素含量测定 精密吸取 0. 100 mg/m l木犀草素对照
金银花叶中木犀草素的分离与鉴定
王丽婷 1 , 王丽娟 2
(1. 宁夏大学政法学院 ,宁夏 银川 750021; 2. 宁夏回族自治区吴忠市人民医院 ,宁夏 银川 750002)
摘要 :目的 建立一种可以从金银花叶中分离出木犀草素的方法 。方法 采用超声提取 ,石油醚回流脱色 、大孔树脂柱和
聚酰胺柱分离相结合的方法 ,通过薄层色谱 、紫外光谱 、红外光谱 、高效液相色谱进行鉴定 ,最终得到木犀草素产品 。结 果 此产品纯度最高可达 81. 6% ,得率为 28. 9μg·g- 1。结论 建立了从金银花叶中分离木犀草素的新工艺 。
S10 0. 554 0. 689 1. 000 0. 649 0. 563
S11 0. 917 0. 750 0. 649 1. 000 0. 820
S12 0. 745 0. 735 0. 563 0. 820 1. 000
R
0. 442 0. 338 0. 397 0. 401 0. 471
S7 0. 381 0. 184 0. 363 0. 130 0. 148 0. 566 1. 000 0. 803 0. 763 0. 696 0. 879 0. 840 0. 393
图 1 产品色谱图
直线回归方程为 Y = 33 578. 22C - 11. 807 ( Y代表峰面积 , C代表
木犀草素浓度 mg /m l) , R2 = 0. 999 7;木犀草素在 0. 02～0. 1 mg / m l范围内呈良好的线性关系 。
2. 2 上柱样品的制备 用 20倍量的 50% 乙醇超声浸提黄酮后 ,
样品
S8
S9
S10
S11
S12
S1
0. 483 0. 410 0. 343 0. 396 0. 545
S2
0. 222 0. 129 0. 223 0. 191 0. 280
S3
0. 469 0. 283 0. 368 0. 372 0. 410
S4
0. 167 0. 115 0. 217 0. 139 0. 207
品溶液 2. 0, 4. 0, 6. 0, 8. 0, 10. 0 m l于 10 m l容量瓶中 ,用流动相
(甲醇 : 0. 02%磷酸 = 50 : 50)定容至刻度 ,选择色谱柱为 ZOR2
BAXSB - C18柱 ( 250 mm ×4. 6 mm , 5 μm , Agilent公司 ) ;以甲醇 : 0. 02%磷 酸 = 50 ∶50 为 流 动 相 ; 在 检 测 波 长 350 nm , 柱 温 30℃;流速为 1. 0 m l/m in的条件下进样 20. 0μl。记录峰面积 ,得
关键词 :金银花叶 ; 木犀草素 ; 分离 ; 鉴定 DO I标识 : doi: 10. 3969 / j. issn. 100820805. 2010. 11. 110 中图分类号 : R284. 2 文献标识码 : B 文章编号 : 100820805 (2010) 1122947203
S6 0. 746 0. 816 0. 877 0. 806 0. 820 1. 000
S7 0. 381 0. 184 0. 363 0. 130 0. 148 0. 566
S8 0. 483 0. 222 0. 469 0. 167 0. 185 0. 514
S9 0. 410 0. 129 0. 283 0. 115 0. 121 0. 369
色谱条件的优化 在色谱条件优化过程中 ,流动相分别比较 了甲醇 - 水 、甲醇 - 磷酸水 、乙腈 - 水 ,最后选择了乙腈 - 水进行
梯度洗脱 ,因千斤拔组分 k分’ 布区域较广 ,因此采用曲线梯度洗 脱 。柱温分别考察了 25, 30, 35 ℃,流速分别考察了 0. 8, 1, 1. 2 m l/m in,最后发现柱温 、流速对色谱行为影响不大 ,综合考虑 ,最 后选择柱温为 30 ℃,流速为 1 m l/m in。选择波长时 ,参考 3D 色 谱图进行选择 ,并提取不同波长通道进行比较 ,最后确定 274 nm 时色谱图峰较多 ,丰度较好 ,不同波长的色谱图比较见图 1 ( b) 。
[ 2 ] 宋立人 ,洪 恂 ,丁续亮 ,等. 中国中药学大辞典 (上 ) [M ]. 北京 :人 民卫生出版社 , 2001: 195.
[ 3 ] 饶伟文 ,黄建楷 ,温志芳 ,等. 千斤拔的品种调查与质量研究 [ J ]. 中 草药. 1999, 30 ( 3) : 219.
[ 4 ] 周 颖 ,王 彦 ,王刃锋. 半边莲药材 HPLC指纹图谱的研究 [ J ]. 中成药 , 2007, 29 ( l2) : 1717.
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期
表 3 12批样品的相似度计算结果
样品 S1
源自文库S2
S3
S4
S5
S6
S1 1. 000 0. 816 0. 831 0. 733 0. 741 0. 746
图 2 产品加标后色谱图
倍柱体积的蒸馏水洗掉蛋白和糖类等大分子杂质 ,再用 70%的
由以上色谱峰可见 ,此类产品中木犀草素的纯度较高 。
乙醇以最大流速洗脱 ,收集 2～8倍柱体积的洗脱液 ,浓缩后得到 3. 1. 3 紫外图谱法 采用标准品木犀草素 (结构如图 3)和样品
样品 。
对照的方法进行紫外图谱 [3 ]鉴定 。使用的移动剂为无水醋酸钠
将提取液浓缩 ,然后按照质量比 (金银花叶和聚酰胺粉的质量 )
为 15∶1的比例混入聚酰胺 ( 80 ～100 目 )粉 ,使其保持松散 ,不
结块 ,将此固体粉末取出 ,放在索氏提取器中用石油醚回流脱色
10次后 ,取出此固体粉末 ,挥干石油醚 ,即得黄酮粗品拌料 ,然后
经过物料比 (黄酮粗品拌料与大孔树脂质量比 )为 1 ∶6,柱径与 柱长比为 1∶6的 HPD100型大孔树脂柱进一步分离富集 ,先用 2
待收集更多确定品种和来源的样品后 ,可建立大叶千斤拔 、 蔓性千斤拔的判别函数 ,用以确定未知样品的归属 ,或建立人工 神经网络模型 ,以更好地区分两种千斤拔 ,更好的应用于中成药 的质量标准控制 。本文所建方法简便 ,灵敏 ,为两种千斤拔的鉴 别提供了新的方法 。
参考文献 :
[ 1 ] 国家药典委员会. 中国药典 , Ⅰ部 [ S ]. 北京 : 化学工业出版社 , 2005:附录 22.
R 0. 878 0. 950 0. 974 0. 942 0. 946 0. 858 0. 393 0. 442 0. 338 0. 397 0. 401 0. 471 1. 000
3 讨论 实验曾考察了氯仿 、醋酸乙酯 、甲醇为提取溶媒进行提取 ,考
察了冷浸提取 、超声提取 、冷浸后超声提取等方法 ,最后确定用甲 醇冷浸后超声提取 30 m in效果最好 ,且方法简便 。
金银花是名贵中药材 ,含有多种有效成分 ,木犀草素作为一 种黄酮单体 ,具有抗炎 、抗菌 、抗癌 、抑酶 、抗氧化 、利胆利尿等多 种作用 ,金银花叶作为金银花的一种副产物 ,产量较大 ,而且常常 被浪费掉 ,研究表明 ,金银花叶中木犀草素的含量平均是花中的
收稿日期 : 2009211223; 修订日期 : 2010203225 基金项目 :宁夏高等学校科研项目 ;宁夏大学基金项目 (No. LG0402) 作者简介 :王丽婷 (19822) ,女 (汉族 ) ,宁夏吴忠人 ,现任宁夏大学政法学 院讲师 ,硕士学位 ,主要从事天然产物研究工作.
比较二者色谱图 ,直观上很难看出两者的差异 ,因此必须从 量化指标对两者进行进一步比较 。从主成分投影图上可看出大 叶千斤拔 、蔓性千斤拔能较好的分开 。
本研究以 24个色谱峰为量化指标进行聚类分析 ,对每个样 品的主成分得分进行聚类分析 ,结果大叶千斤拔归为一类 ,蔓性 千斤拔归为一类 ,与预期目标一致 。待收集更多千斤拔样品后 , 作进一步比较 ,将会获得更多和更为准确的信息 。
2. 8倍 [1, 2 ] ,但目前对于金银花叶中木犀草素的研究仅限于含量 测定 ,对于木犀草素产品的分离 、纯化还未见报道 。本文采用超 声提取 ,石油醚回流脱色 、大孔树脂柱和聚酰胺柱分离相结合的 方法从金银花叶中分离出了黄酮单体木犀草素 ,并结合聚酰胺薄 层色谱 、红外光谱 、紫外光谱 、高效液相色谱等方法对分离后得到 的木犀草素产 品 进 行 定 性 鉴 定 和 定 量 分 析 , 其 纯 度 最 高 可 达 81. 6% ,得率为 28. 9μg·g- 1。 1 仪器与材料
紫外 - 可见分光光度计 UV - 2450 (日本岛津公司 ) ;电子分
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期
L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2010 VOL. 21 NO. 11
析天平 ;旋转蒸发器 RE - 52AA (上海亚荣生化仪器厂 ) ; Agilent 谱图如图 1～2,结果发现 ,产品加标后的色谱峰保留时间不变
S10 0. 343 0. 223 0. 368 0. 217 0. 212 0. 278
S11 0. 396 0. 191 0. 372 0. 139 0. 158 0. 387
S12 0. 545 0. 280 0. 410 0. 207 0. 221 0. 262
R 0. 878 0. 950 0. 974 0. 942 0. 946 0. 858
S5
0. 185 0. 121 0. 212 0. 158 0. 221
S6
0. 514 0. 369 0. 278 0. 387 0. 262
S7
0. 803 0. 763 0. 696 0. 879 0. 840
S8
1. 000 0. 623 0. 554 0. 917 0. 745
S9
0. 623 1. 000 0. 689 0. 750 0. 735