中国药典-高效液相色谱

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
16
分离度(R)

用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度,是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度,也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分(内标物质或其 他难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品用适 当的方法降解,通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度,对色谱系统进行评价与控制。
8
二极管阵列检测器 (diode array detector,DAD)
特点:在任一时间内,均可同时得到
物质在不同波长下的吸收情况,即三
维图谱
多组分混合物的三维图谱
流动相


反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统(采用紫外末 端波长检测时,首选乙腈-水系统),如经试用不适合 时,再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液 的流动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态,故对于十 八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统,流动 相中有机溶剂的比例通常应不低于5%,否则C18链的 随机卷曲将导致组分保留值变化,造成色谱系统不稳 定。
27



ห้องสมุดไป่ตู้

正文规定的定量方法如果不是内标法,建议用固定体积的定量环 进样器; 色谱柱通常为不锈钢柱,其尺寸规定在正文中(长度和内径); 正文中规定的固定相如以字母表示,即指本节所附的固定相,该 固定相的粒度在字母后的括号内写明,有时标明适用牌号,并不 等于别的牌号不能用。 本节所附的固定相有:固定相A为硅胶颗粒,固定相B为表面化学 键合辛烷基硅烷的硅胶颗粒,固定相C为表面化学键合十八烷基 硅烷的硅胶颗粒。 除另有规定外,色谱分离是在恒定的室温下进行,光度检测器的 流通池体积以10ul为宜。对色谱条件的变更未作详细说明,但说 明了分析工作者改变色谱条件,应能得到与要求一致的结果。溶 剂和试剂的质量应适于液相色谱法的应用。
21








再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液,注入仪 器,记录色谱图,测量供试品中待测成分和内标物质 的峰面积或峰高,按下式计算含量: Ax 含量(Cx)=f·───── As内/Cs内 式中 Ax为供试品(或其杂质)峰面积或峰高; Cx为供试品(或其杂质)的浓度; As内为内标物质的峰面积或峰高;Cs内为内标物质的浓 度; f为较正因子。 22
28
测定法

(1)内标法 按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和内
标物质,分别配成溶液,精密量取各适量,混合配成校正因子测 定用的对照溶液。取一定量注入仪器,记录色谱图。测量对照品 和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算校正因子: As/Cs 校正因子(f)=───── AR/CR 式中 As为内标物质的峰面积或峰高; AR为对照品的峰面积或峰高; Cs为内标物质的浓度; CR为对照品的浓度。

美国药典第24版


通法中的高效液相色谱法,简要说明了本法的特点, 指出了本法用于大多数药物分析是以分配色谱法为基 础,可在30min内完成。叙述分仪器和方法两部分。在 仪器项下,详细分述了泵系统、进样器、柱、检测器 和数据收集装置。 关于检测器,重点讨论了常用的分光光度检测器。对 于配有单色器的可变波长检测器的波长准确度,应该 用该仪器制造厂提供的方法进行校正,如果观察到的 波长与正确的波长相差3nm以上,则提示需进行再校 正。

(2)外标法:按各品种项下的规定,精密称(量
)取对照品和供试品,配制成溶液,分别精密取一定 量,注入仪器,记录色谱图,测量对照品溶液和供试 品溶液中待测成分的峰面积(或峰高),按下式计算 含量 含量(cX)=cR(AX/AR) 式中各符号意义同上。 由于微量注射器不易精确控制进样量,当采用外标法 测定供试品中成分或杂质含量时,以定量环或或自动 进样器进样为好。
23



(3)面积归一化法按各品种项下的规定,配制供
试品溶液,取一定量注入仪器,记录色谱图。测量各 峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积, 计算各峰面积占总峰面积的百分率。

用于杂质检查时,由于峰面积归一化法测定误差大, 因此,通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。 除另有规定外,一般不宜用于微量杂质的检查。

18
重复性

用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重复 性能。采用外标法时,通常取各品种项下的对 照品溶液,连续进样5次,除另有规定外,其 峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0% ;采用内标法时,通常配制相当于80%、100 %和120%的对照品溶液,加入规定量的内标 溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少进 样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏差 也应不大于2.0%。
17


无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标峰 或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另外有规定外,待 测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式 为: 2(tR2-tR1) 2(tR2-tR1) R=─────── 或 R=────────── W1+W2 1.70( W1,h/2+W2,h/2) 式中 t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间; tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间; W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。 当对测定结果有异议时,色谱柱的理论板数(n)和分离度(R) 均以峰宽(W)的计算结果为准。
26
英国药典2000年版



附录ID 液相色谱法,简要叙述了仪器、方法、归一化法、效能及 与正文有关的内容。在方法项下,说明要用对照溶液测试,以决 定仪器的设置和获得适当响应的注样量,进行重复进样以验证重 复性,必要时,还要检测理论板数。 除另有规定外,测定被测物峰的峰面积。若被测物峰的对称因子 为0.8-1.2,也可测定峰高。在应用梯度洗脱时,则测定峰面积。 在归一化项下,说明在用归一化法测定时最好使用宽范围放大器 和自动积分仪。 相邻两峰的分离度以半高宽和保留时间的公式计算,对称因子的 计算公式与中国药典中的拖尾因子公式相同,并列出了容量因子 计算公式和信噪比测定法。在与正文有关内容项下,建议流动相 要经脱气,脱气装置应不影响流动相的组成;
仪器包括: 储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器
3
色谱柱



反相色谱系统使用非极性填充剂,常用的色谱柱填充 剂为化学键合硅胶,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常 用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也 有使用。 正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶 等。 离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色 谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异 构体的分离通常使用手性填充剂。
19
拖尾因子(T)





用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精 度,应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的 规定。拖尾因子计算公式为: W0.05h T=────── 2d1 式中 W0.05h为0.05峰高处的峰宽; d1为峰极大至峰前沿之间的距离。 除另有规定外,峰高法定量时T应在0.95~1.05之间。 峰面积法测定时,若拖尾严重,将影响峰面积的准确 测量。必要时,应在各品种项下对拖尾因子作出规定 20
6
检测器





最常用的检测器为紫外检测器,包括二极管阵列检测器、其他常 见的检测器有荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器 、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅与供 试品溶液的浓度有关,还与化合物的结构有关; 示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器,对所有的 化合物均有响应; 蒸发光散检测器对结构类似的化合物,其响应值几乎仅与供试品 的质量有关; 二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱,故可用于供 试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
中国药典
高效液相色谱
1
定义

高效液相色谱法
系采用高压输液泵将规定的流动相泵入 装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分 离测定的色谱方法。 注入的供试品,由流动相带入柱内,各组 分在柱内被分离,并依次进入检测器, 由积分仪或数据处理系统记录和处理色 谱信号。
2
一、对仪器的一般要求和色谱条件

所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符 合有关规定
14
二、系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通包括 理论板数 分离度 重复性 拖尾因子 分离度和重复性是尤为重要。
15
色谱柱的理论板数(n)


用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色 谱柱上的色谱行为不同,采用理论板数作为衡量柱效 能的指标时,应指明测定物质,一般为待测组分或内 标物质的理论板数。 在规定的色谱条件下,注入供试品溶液或各品种项下 规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成 分峰或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计,下 同,但应取相同单位)和峰宽(W)或半高峰宽( Wh/2),按n=16(tR/w)2或n=5.54(tR/Wh/2) 2计算色谱 柱的理论板数。
7
检测器


紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供 试品溶液的浓度在一定范围内呈线性关系,但蒸发光 散射检测器响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关 系,故进行计算时,一般需经对数转换。 不同的检测器,对流动相的要求不同。如采用紫外检 测器,所用流动相应符合紫外—可见分光光度法(附 录V A)项下对溶剂的要求;采用低波长检测时,还应 考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱 级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不 允许使用含不挥发盐组分的流动相。
5
注意




以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过 40℃,为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度 ,但不宜超过60℃ 流动相的PH值应控制在2~8的。当PH大于8时,可使 载体硅胶溶解;当PH小于2时,与硅胶相连的化学键 合相易水解脱落。 当色谱系统中需使用PH值大于8的流动相时,应选用 耐碱的填充剂,如采用高纯硅胶为载体并具有高表面 覆盖度的键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂 当需使用PH值小于2的流动相时,应选用耐酸的填充 剂,如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二 异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂
25



美国药典还讨论了多波长检测器,特别是二极管阵列多波长检测 器的特点,指出,二极管阵列检测器比固定波长检测器或可变波 长检测器的信噪比低,不适宜于低浓度化合物的分析。在讨论示 差折光检测器中,认为该检测器不如紫外光检测器灵敏,且受溶 剂组成、流速、温度变化的影响大,要得到满意的基线,需用参 比柱。 在方法项下,强调要用高纯度的试剂和HPLC级的有机溶剂,色谱 用水的电导率和紫外吸收应低,并指出,流动相的组成对容量因 子的影响远大于温度的影响。本部分还讨论了梯度洗脱的应用、 检测器的线性动态范围(即检测器信号响应与被测成分量呈比例 的范围)、自动进样测定、外标法和内标法测定和系统适用性试 验。在通法中还有专门一节讨论系统适用性试验。
4
色谱柱


填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积 、键合基团的表面覆盖度、含炭量和键合类型等)以 及色谱柱的填充,直接影响供试品的保留行为和分离 效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在 15nm以下的填料,分析分子量大于2000的化合物则应 选择孔径在30nm以上的填料。 普通分析柱的填充剂粒径一般在3~10µm之间。粒径 更小(约2µm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约 2mm)。
相关文档
最新文档