蜂胶总黄酮抗氧化和抗肿瘤活性研究-王启海

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第22卷 第12期 2020 年 12 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 22 No. 12 Dec .，2020
蜂胶总黄酮抗氧化和抗肿瘤活性研究
王启海1，左坚2，梁枫1，裴文俊3，张梦雨1
（1.安徽中医药高等专科学校，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院附属弋矶山医院，安徽 芜湖 241001；
3.皖南医学院安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241002）基金项目：国家自然科学基金（81603388）；安徽省高校学科（专业）拔尖人才学术项目（gxbjZD65）；安徽中医药高专自然科学研究重点项目 （ZRKXZ201901）作者简介：王启海（1980-），男，安徽霍邱人，副教授，硕士，研究方向：天然药物活性成分筛选研究。

摘要：目的 研究蜂胶总黄酮（total flavonoids of propolis，TFP）的抗氧化活性及其对小鼠肝癌Hepa1-6细胞、人
肺癌A549细胞和人胃癌SGC7901细胞增殖的抑制作用。

方法 通过测定TFP 的总还原力及对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力，评价TFP 的体外抗氧化活性；采用CCK-8法检测蜂胶总黄酮抗肿瘤细胞增殖的能力。

结果 实验结果表明，在25~150 μg/mL 浓度范围内TFP 具有较强的总还原力，对DPPH 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力均呈现浓度依赖性增大，最大清除率分别为（72.47±3.13）%、（70.84±4.01）%和（68.24±4.56）%；50、100、200 μg/mL 的TFP 对Hepa1-6、A549和SGC7901细胞的生长均有明显的抑制作用，且在24~72 h 时间范围内的抑制作用随时间延长而逐渐增大。

结论 TFP 在体外具有较强的抗氧化能力，且对Hepa1-6、A549和SGC7901细胞的生长具有显著的抑制作用。

关键词：蜂胶；总黄酮；抗氧化；肿瘤细胞；生长抑制
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2020) 12- 0037- 05
Antioxidant and Antitumor Activities of Total Flavonoids Extracted from Propolis WANG Qihai 1，ZUO Jian 2，LIANG Feng 1，PEI Wenjun 3，ZHANG Mengyu 1
（1. Anhui College of Traditional Chinese Medicine，Wuhu 241002，Anhui，China；2.Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001，Anhui，China；3.Anhui
Key Laboratory of Wannan Medical College，Wuhu 241002，Anhui，China）
Abstract：Objective To study the antioxidant activity of total flavonoids extracted from propolis
（TFP）.The inhibitory effect of TFP on the proliferation of Hepa1-6，A549 and SGC7901 cells. Methods The antioxidant activity of TFP were evaluated by measuring the total reducing power and its scavenging ability to DPPH，hydroxyl and superoxide anion free radicals. Growth inhibitory effect of total flavonoids on tumor cells was assessed by CCK-8 assay. Results Results showed that the TFP had
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DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2020.12.009
辽宁中医药大学学报22卷
蜂胶是工蜂采集各种植物芽、叶中的树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合后形成的具有芳香气味的黏性固体胶状物[1]。

蜂胶作为传统药品和保健品使用历史非常悠久。

国内外研究表明，蜂胶具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等广泛的生物活性[2-4]，蜂胶中存在多类化学成分，其中包括黄酮类、酚酸类、萜烯类化合物等主要药效成分。

姚静等[5]采用 LC-IT-TOF-MS法进行鉴别，发现中国蜂胶中含有高良姜素及酯类、槲皮素及酯类、短叶松素及酯类、白杨素等20余种黄酮类成分。

实验研究表明，从多种天然药物中得到的总黄酮类提取物具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒、保护心脑血管和抗肿瘤等作用[6-9]，近年来，蜂胶总黄酮（total flavonoids of propolis，TFP）的药理作用研究也广受关注，但对其抗氧化和抗癌作用的研究报道较少。

本实验室前期研究表明，TFP具有显著的血管舒张作用[10]，对全脑缺血-再灌注大鼠脑损伤具有明显的保护作用[11]。

本实验通过测定总还原力以及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除率，研究了TFP的体外抗氧化能力，并以小鼠肝癌Hepa1-6细胞、人肺癌A549细胞和人胃癌SGC7901细胞为研究对象，探讨了TFP对肿瘤生长的抑制能力。

1 材料与方法
1.1材料
肿瘤细胞株：小鼠肝癌Hepa1-6细胞由皖南医学院中心实验室保存，肺癌A549细胞和胃癌SGC7901细胞均由中国科学院上海细胞库提供。

药品与试剂：蜂胶由广州杰禾蜂业有限公司提供；芦丁对照品由上海金穗生物科技有限公司提供（批号：20160227）；D101型大孔吸附树脂由郑州艾诺化工科技有限公司提供；DPPH由东京化成工业株式会社提供（批号：FBYXL-OT）；维生素C（Vc）对照品由中国食品药品检定研究院提供（货号：SH-A1300000）；邻苯三酚、Tris由北京索莱宝科技有限公司提供；DMEM高糖培养基、胎牛血清均由美国Gibco公司提供；CCK-8试剂盒由合肥睿捷生物科技有限公司提供（批号：9A11BL001）；三氯乙酸、三氯化铁、无水乙醇等试剂均为国产分析纯；双蒸水由本校中心实验室制备。

1.2仪器与设备
TU1901型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；LH-08B型药材粉碎机（湖南中诚制药机械厂）；JK-2500B型超声波提取仪（合肥金尼克机械制造有限公司）；RE-5298A型旋转蒸发仪（西安禾普生物科技有限公司）；FD8-10型冷冻干
燥器（美国SIM公司）；Anthos Zenyth 200型全波长酶标仪（英国Biochrom公司）；FA1204N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；HHR40-Ⅱ-A2型生物安全柜（青岛海尔特种电器有限公司）；W2001R 二氧化碳培养箱（美国SIM公司）；IX73型荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.3实验方法
1.3.1 TFP的提取与纯化
TFP提取与纯化工艺根据参考文献[12-13]改进。

将蜂胶冷冻过夜，切块后粉碎，精密称取蜂胶细粉约100 g，按料液比1∶25加入80%乙醇，浸提24 h 后，30 ℃超声波辅助提取30 min，将提取液抽滤后减压蒸馏法回收溶剂，冷冻干燥得TFP粗提物。

取TFP粗提物适量，加纯化水超声溶解，上D101型大孔吸附树脂柱，上样量为1.5 BV，上样流速为18 BV/min，用60%乙醇洗脱，收集洗脱液后减压浓缩，干燥，得TFP粉末。

选用芦丁为对照品，采用硝酸铝显色法，检测波长为500 nm，测定纯化后TFP 的百分含量。

1.3.2 还原能力测定
TFP还原能力测定参照文献进行改进[14]。

移取不同浓度的样品溶液各2.00 mL，每支样品管分别加入pH 6.8的磷酸盐缓冲液和质量浓度为1%的铁氰化钾溶液各2.50 mL，混合均匀后置50 ℃水浴反应20 min，快速冷却后加入质量浓度为10%的三氯乙酸溶液2.50 mL，再次混匀后3000 r/min离心10 min，取上清液2.50 mL，加2.50 mL双蒸水，再加入质量浓度为0.1%的三氯化铁溶液0.50 mL，混匀，室温静置10 min，在700 nm波长处测定溶液的吸光度。

以Vc 做阳性对照。

吸光度值越大说明还原能力越强。

1.3.3 DPPH自由基清除能力测定
取适量纯化后的TFP，用50%乙醇配制成含不同总黄酮质量浓度的样品溶液。

移取上述样品溶液各2.00 mL，分别加入2.00 mL DPPH乙醇溶液，混合均匀后，室温避光反应30 min，测定517 nm波长处得吸光度值A样品。

用2.00 mL 50%乙醇代替样品溶液，在其他条件相同的条件下测得空白吸光度A空白。

移取样品溶液各2.00 mL，分别加入无水乙醇 2.00 mL，混合均匀后，在其他条件相同的情况下测得吸光度值A对照。

精密称取Vc适量，配制成与样品溶液中总黄酮浓度相同的溶液作为对照溶液，同法操作作为阳性对照[15]。

按下式分别计算样品溶液和Vc对DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率（%）=[A空白-（A样品-A对照）]/A空白×100%。

1.3.4 羟基自由基清除能力测定
参照文献[16]进行，精密移取“1.3.2”中样品溶液各2.00 mL，分别加入9 mmol/L FeSO4溶液和9 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液各2.00 mL，混匀后再分别加入
strong reducing ability，DPPH、hydroxyl and superoxide anion free radical scavenging rate could reach （72.47±3.13）%，（70.84±4.01）% and（68.24±4.56）%，respectively. The TFP at the concentration of 50，100，200 μg/mL significantly inhibited the growth of Hepa1-6，A549 and SGC7901 cells，and the inhibitory effect increased with time in the range of 24 to 72 hours. Conclusion TFP had strong antioxidant capacity in vitro and could significantly inhibit the proliferation of Hepa1-6，A549 and SGC7901 cells.
Keywords：propolis；total flavonoids；antioxidant；tumor cells；growth inhibition
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0.3%的H2O2 0.20 mL、双蒸水2.00 mL，37 ℃水浴加热30 min，然后在510 nm波长处测定吸光度值A样品。

以双蒸水代替TFP样品溶液，其他操作相同，测得空白吸光度A空白。

以双蒸水代替H2O2，在其他条件不变的情况下测得吸光度值A对照。

以与样品溶液中总黄酮浓度相同的Vc溶液为阳性对照。

按下列公式计算羟基自由基清除率。

羟基自由基清除率（%）=[A空白-（A样品-A对照）]/A空白×100%。

1.3.5 超氧阴离子自由基清除能力测定
根据参考文献[17]略作改进，取50 mmol/L、pH 8.2的Tris-HCl溶液4.50 mL与4.20 mL双蒸水混合后，25 ℃恒温水浴20 min，取出后分别加入不同浓度的TFP溶液，然后迅速加入经25 ℃预热的6 mmol/L邻苯三酚溶液0.50 mL，立即混匀，反应4.5 min后加入10 mmol/L盐酸溶液1 mL终止反应，在320 nm波长处测定吸光度值A样品。

以双蒸水代替总黄酮溶液，测得吸光度值A空白。

以双蒸水代替邻苯三酚溶液，测得吸光度值A对照。

按照相同方法，以相同浓度的Vc做阳性对照。

根据下列公式计算超氧阴离子自由基清除率。

超氧阴离子自由基清除率（%）=[A空白-（A样品-A对照）]/A空白×100%。

1.3.6 肿瘤细胞培养
取小鼠肝癌Hepa1-6、人胃癌SGC7901和人肺癌A549细胞分别接种于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基中，接种后置于5% CO2培养箱中37 ℃恒温培养。

[18-20]
1.3.7 CCK-8法检测TFP对肿瘤细胞增殖的抑制作用
参照CCK-8试剂盒说明书操作。

分别取处于对数生长期的Hepa1-6、A549和SGC7901细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化2 min后，弃去消化液，加适量培养液终止消化后，将细胞吹打成单细胞悬液，并调整细胞浓度为4.0×104个/mL。

将细胞悬液按每孔100 μL接种于96孔板中，在5% CO2培养箱中37 ℃、饱和湿度条件下培养24 h。

用药组分别加入高、中、低3个浓度的TFP溶液，对照组每孔加入100 μL培养液，每组5孔，重复做3次。

加药后继续在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24、48、72 h后弃去上清液后，每孔加100 μL培养液和10 μL CCK-8溶液，继续培养1 h后，用酶标仪在450 nm波长处测定每孔吸光度值，按下列公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，式中，A X为实验组在450 nm波长处的吸光度均值；A O为对照组在450 nm波长处的吸光度均值。

细胞增殖抑制率（%）=（1-A X/A O）×100%。

1.4统计学处理
采用SPSS20.0软件进行统计学分析，所有实验重复进行3次，实验结果以x—±s表示，组内比较采用单因素方差分析，组间差异比较采用最小显著性差异（Least Significant Difference，LSD）法，P<0.05表示差异具有显著性，P<0.01表示差异极为显著。

2 结果
2.1TFP对DPPH自由基的清除率
不同浓度的TFP对DPPH自由基清除率结果见图1。

在25~150 μg/mL浓度范围内，TFP对DPPH自由基清除率呈浓度依赖性增大，当浓度为150 μg/mL时，最大清除率为（72.47±3.13）%，小于同
浓度下Vc的清除率（94.73±3.68）%（P<0.01）。

TFP 对DPPH自由基的半数清除率EC50为71.01 μg/mL。

2.2TFP对羟基自由基的清除率
不同浓度的TFP清除羟基自由基的能力见图2。

TFP浓度在25~150 μg/mL范围内对羟基自由基的清除能力具有浓度依赖性，最大清除率可达到（70.84±4.01）%，与Vc的最大清除率（91.79±2.17）%相比，差异仍具有高显著性（P<0.01）。

TFP对羟基自由基半数清除率EC50为
73.63 μg/mL。

注：与Vc对照组比较，**P<0.01
图1 TFP对DPPH自由基清除率测定结果（n=15，x—±s
）注：与Vc对照组比较，**P<0.01
图2 TFP对羟基自由基清除率测定结果（n=15，x—±s）2.3TFP对超氧阴离子自由基的清除率
如图3所示，在25~150 μg/mL范围内，TFP对超氧阴离子自由基的清除能力随浓度增加而逐渐增大，其最大清除率可达到（68.24±4.56）%，但仍明显低于Vc的最大清除率（89.12±2.05）%（P<0.01）。

TFP对超氧阴离子自由基半数清除率EC50为84.85 μg/mL。

2.4TFP的还原能力
如图4所示，TFP具有较强的总还原能力，在25~150 μg/mL范围内，还原能力随浓度增大而逐渐增强，最大吸光度值为（0.96±0.05），与Vc还原能力吸光度值（1.42±0.07）相比，差异仍具有高显著性（P<0.01）。

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卷
注：与Vc 对照组比较，**P <0.01
图3 TFP 对超氧阴离子自由基清除率
测定结果（n =15，x —
±s
）
注：与Vc 对照组比较，**P <0.01
图4 TFP 总还原能力测定结果（n =15，x —
±s ）
2.5 蜂胶总黄酮对肿瘤细胞增殖的抑制作用
CCK-8实验结果见图5，蜂胶总黄酮对
Hepa1-6、A549和SGC7901 3种细胞的生长均有非常显著的抑制作用（与溶媒对照组比较，P <0.01），且具有剂量和时间依赖性。

作用72 h 后，50、100、200 μg/mL 3种浓度的蜂胶总黄酮对Hepa1-6细胞增殖抑制率分别为（31.28±2.01）%、（63.31±2.98）%和（78.62±2.49）%，对A549细胞增殖抑制率分别为（48.37±3.27）%、（71.15±3.12）%和（84.68±3.45）%，对SGC7901细胞增殖抑制率分别为（42.45±2.99）%、（73.13±3.68）%和（88.31±3.81）
%。

注：A：Hepa1-6细胞，B：A549细胞，C：SGC7901细胞；
与溶媒对照组（Control）比较，**P <0.01；与TFP 50 μg/mL 组比较，##P <0.01；与TFP 100 μg/mL 组比较：$$P <0.01；与24 h 组比较，&&P <0.01；与48 h 组比较：@P <0.05，@@P <0.01
图5 TFP 对肿瘤细胞增殖的影响（n =15，x —
±s ）
3 讨论
心脑血管系统、肿瘤等多种疾病和人类的自
然衰老都与氧自由基密切相关[21-22]。

黄酮类化合物的抗自由基作用已经得到大量实验证实，从天然药物中筛选具有较强抗氧化活性的黄酮类化合物已成为新药研究与开发重点关注的领域。

总还原能力测定以及DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基等清除率测定是评价天然活性成分体外抗氧化活性的常用方法。

DPPH 是一种人工合成的比较稳定的含氮自由基，其乙醇溶液在517 nm 处有特征吸收，外加抗氧剂可与DPPH 结合，使其颜色和吸光度发生变化，可用于评价抗氧
剂清除自由基的能力[23]。

通过Fenton 反应产生的具有高反应活性的羟基自由基可与水杨酸结合，生成在510 nm 处有强烈吸收峰的2，3-二羟基苯甲酸。

在体系中加入可清除部分羟基自由基的物质可减少吸收峰的形成，用分光光度法测定体系的吸光度值可反应自由基的含量，从而间接测定样品的抗氧化能力[24]。

超氧阴离子是一类重要的活性氧自由基，可诱导大分子物质产生氧化损伤，因此通过测定对超氧阴离子自由基的清除作用可以评价物质的抗氧化能力大小[25]。

本研究以蜂胶总黄酮为对象，通过体外抗氧化实验评价了蜂胶总黄酮的抗氧化能力。

实验结果表明，蜂胶总黄酮具有较强的总还原能力，对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均具有较强的清除能力，并在一定范围内呈现浓度依赖性，其EC 50值分别为71.01、73.63、84.85 μg/mL，但总还原能力和自由基清除能力均弱于Vc。

蜂胶总黄酮的抗氧化能力可能与其含有的高良姜素、短叶松素、白杨
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素等成分能调节体内黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、环氧合酶-2、诱导性一氧化氮合酶等活性物质有关[26-28]。

肿瘤是临床发病率和病死率均较高的疾病之一，目前临床使用的多数抗癌化疗药物毒性均较大，因此，开发高效、低毒的天然抗肿瘤药物已成为重要研究方向。

近年来研究表明，多种天然药物中提取出的黄酮类化合物具有明确的抗肿瘤活性，其作用机制可能涉及诱导肿瘤细胞凋亡、清除自由基、抑制肿瘤血管生成等多种途径[29-31]。

本实验在研究蜂胶总黄酮抗氧化活性的基础上，采用CCK-8法探讨了蜂胶总黄酮对3种肿瘤细胞生长的抑制能力。

研究结果表明，蜂胶总黄酮对Hepa1-6、A549和SGC7901 3种肿瘤细胞生长均具有显著的抑制作用，且在总黄酮浓度50~200 μg/mL 范围内、作用时间24~72 h范围内呈现出明显的浓度和时间依赖性，200 μg/mL蜂胶总黄酮在作用72 h后对Hepa1-6、A549和SGC7901细胞的抑制率分别达到了（78.62±2.49）%、（84.68±3.45）%和（88.31±3.81）%。

肿瘤的发病机制众多，有研究发现氧自由基与肿瘤的发生密切相关，较多的致癌物在体内经过代谢活化后形成自由基，在肿瘤发生过程中占有非常重要的角色，有效地控制自由基也是防止癌变的重要措施之一[21]。

因此，可以推测蜂胶总黄酮对肿瘤细胞增殖的抑制作用也可能与其抗氧化活性有关。

综上所述，蜂胶总黄酮具有较好的体外抗氧化活性，总还原能力较强，对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基具有较高的清除能力，而且蜂胶总黄酮能抑制肿瘤细胞的生长，对Hepa1-6、A549和SGC7901细胞增殖抑制作用均较强，其抗肿瘤作用的详细机制尚有待于深入探讨。

本研究为蜂胶药材的进一步开发与利用提供了参考。

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