有机磷酸酯类中毒及解救

有机磷酸酯类中毒及解救
【实验目的】
观察有机磷酸酯类中毒的症状和血液胆碱酯酶活力的抑制情况，通过比较阿托品、解磷定的解救作用，掌握两药的作用原理。

【实验原理】
简单复习有机磷中毒机制、症状及解救原则。

一、有机磷酸酯类中毒：胆碱酯酶（CHE）活力受到抑制，失去水解乙酰胆碱（ACh）的能力，ACh在体内蓄积，引起一系列中毒症状：轻度：M样症状（兴奋平滑肌、腺体分泌增多、瞳孔缩小等）；中度：M和N样（骨骼肌兴奋可致肌震颤）症状；重度：M、N和中枢神经系统（可由躁动不安等中枢兴奋转为昏迷等中枢抑制至死亡）症状。

二、解救原则：
1. 清除毒物，避免继续吸收。

2. 特殊治疗：1）M受体阻断剂阿托品：与ACh竞争M 受体，解除有机磷酸酯类中毒M 样症状。

要及早、足量、反复注射，达到阿托品化。

对轻度中毒有效。

对中、重度中毒，合用胆碱酯酶复活药。

2）胆碱酯酶复活药解磷定：能使被有机磷酸酯类抑制的ACHE活力恢复，对M及N样症状有效。

要及早应用，防止酶的老化。

需与阿托品合用，可提高解救效果（因为胆碱酯酶复活药不能对抗中毒时已经聚积在突触间隙的大量ACh激动M受体的作用）。

3．对症治疗：吸氧、人工呼吸，抗休克等。

三、本次实验通过比较阿托品、解磷定对中毒症状的解救及对血液胆碱酯酶活力的影响，进一步掌握两药的作用机制。

【实验对象】
家兔，2.5～3.0kg。

【实验药品与器材】
0.1%硫酸阿托品（atropine sulfate）、5％敌百虫（metrifonate）、1％肝素（heparin）、2.5％碘解磷定（pyraloxime methoiodide，PAM）、恒温水浴、721分光光度计、试管架、试管、吸管（0.2、1、2、5mL)、滤纸、漏斗、注射器（2、5、10mL）、测瞳孔尺、刀片，采血杯、动脉夹，棉球。

【实验步骤】
1．观察正常状态：家兔2只，称重，观察并记录活动情况、呼吸（频率、有无呼吸困难，呼吸道有无分泌物等）、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌张力及有无肌震颤等。

2．取血（中毒前或正常对照）：耳缘静脉取血约0.5ml,分别取0.1ml放入空白管（O）、标准管（S）和给药前管（1#），供测正常胆碱酯酶活性用。

取血方法：用酒精棉球擦拭兔耳缘静脉，当其充血明显时，用刀片横断耳缘静脉，使血液（0.5～1.0mL）自然流入采血杯（杯内预先滴入2滴肝素，自然干燥后备用）中，或用2mL注射器逆血流方向于耳缘静脉采血滴入采血杯中，轻轻振荡采血杯，防止凝血。

3．给药： 5％敌百虫（metrlfonate），1.5ml/kg（75mg/kg）,耳缘静脉注射。

按“1”所述指标观察并记录中毒症状。

4.取血（中毒时）：待中毒症状明显时(肌震颤明显时)，依“2”法再次采血约0.2ml,取0.1ml放入中毒管（2#），供测中毒时胆碱酯酶活性用。

5．解救：取血后，甲兔立即静脉注射0.1% 阿托品1ml／kg(1mg/kg)，乙兔立即静脉注射2.5％碘解磷定4ml/kg(100mg/kg), 按“1”所述指标观察并记录中毒症状有何变化，
特别注意甲兔和乙兔的区别。

6．取血（解救后）：在症状改善明显时，再次采血，放0.1ml于解救管（3#:阿托品解救； 4#：碘解磷定解救）供测解救后胆碱酯酶活性用。

7．实验结束后，甲、乙两兔分别补注解磷定和阿托品。

【注意事项】
1．取血注射器及试管预先肝素化。

2．敌百虫注射时，一定要固定好家兔。

如敌百虫溅到皮肤上，用清水洗，忌用肥皂清洗。

3．中毒解救要及时，以防止酶老化。

可提前准备好解救药。

4．测定胆碱酯酶活性时，各试剂加样顺序切勿颠倒。

5．示教瞳孔、呼吸、唾液分泌的观察及敌百虫注射时如何固定家兔。

【实验结果】
根据本实验的观察项目，列表记录甲乙两兔中毒前后和用不同药物解救后症状及血液胆碱酯酶活性变化。

（注意： OD值反映血中剩余ACh的量，OD值越低，剩余ACh越少，表明胆碱酯酶活力越高。

）
【讨论】
应重点概括中毒前、中毒时和解救后具体的实验现象的变化及胆碱酯酶活性的变化，并联系具体的理论内容，点明阿托品和碘解磷定两药作用及机制的区别。

还可根据各组具体实验过程及结果提及实验过程中影响实验结果的因素。

【思考题】
根据本次实验结果，分析有机磷酸酯类的中毒机制，比较阿托品、解磷定的解救效果并掌握两药的作用原理。

附：胆碱酯酶测定的步骤
按下表操作，每加一种试剂后均需充分摇均，保温时间需严格控制。

步骤
加入量
空白管标准管测定管（1、2、3、4）
pH7.2磷酸盐缓冲液（mL）0.9 0.9 0.9 全血（mL）0.1 0.1 0.1
37℃水浴预热3min
0.007mol/L ACh（mL）/ / 1.0
37℃水浴预热20min
碱性羟胺溶液（mL） 4.0 4.0 4.0
0.007mol/L（mL）/ 1.0 /
室温静置2min
4mol/L 盐酸溶液（mL ） 2.0 2.0 2.0 10％三氯化铁（mL ） 2.0 2.0 2.0 0.007mol/L （mL ）
1.0
/
/
滤纸过滤，于15min 内用光电比色（波长525nm ）
测OD 值
注：测定管1、2、3、4分别为给药前、中毒时、阿托品解救后及解磷定解救后血样。

【计算公式】
注：通常以1mL 血液在规定条件下能分解1µmol 乙酰胆碱定为1个胆酰酯酶活性单位。

计算式中的“70”是由于每管中加有7µmol 乙酰胆碱、0.1mol 血液，7×1.0/0.1＝70
胆碱酯酶活性（U/mL ）＝
标准管光密度－测定管光密度
×10
标准管光密度
药物的半数致死量（LD
）的测定
50
【实验目的】
了解药物半数致死量（LD50）测定的原理、方法、计算过程和意义。

【实验原理】
一、简单复习质反应、量反应、LD50、ED50、治疗指数的概念及意义：
量反应：指效应可用连续数量值表示的反应，如血压、脉搏等。

质反应：指效应用是通过计数（即数阳性反应的个数）而取得的，通常以百分率（％）来表示，如死亡。

LD50在质反应是指药物引起半数实验动物死亡的剂量，是衡量药物的急性毒性大小的重要指标。

ED50在质反应则是指引起半数实验动物产生阳性效应的剂量，是衡量药物效应力强弱的重要指标。

药物的治疗指数：LD50与ED50的比值称为药物的治疗指数（therapeutic index,TI）。

通常以此值表示药物安全性大小，但其又不能完全表示出药物安全性的差别。

因此，安全性还应参考1％致死量（LD1）与95％有效量（ED95）之比值。

二、介绍LD50或ED50测定方法：
可分为两大类，即序贯实验法与分组实验法。

其计算方法可有20多种，其中以Bliss 法在数理上最为严谨，结果很精密，称之为几率单位正规法。

但它步骤多，计算繁杂，虽可用函数计算器加快计算速度，但还是不可能在实验时间内完成，对学生负担重，如因工作需要可参见有关文献。

序贯法，用动物少是此法最大优点，但它只适用于那些作用出现快的药物，不能计算参数。

孙瑞元提出的点斜计算法（综合法），是一种计算简便，精确性好，又可计算全部参数的一种计算法，优于其他简化法，故本实验重点介绍此种计算法。

【实验对象】
昆明种小白鼠，体重18～22g，实验前禁食12h，不禁水。

【实验药品与器材】
盐酸普鲁卡因、小鼠笼、注射器（1mL）、小鼠体重称、计算器（带函数计算器）。

【实验步骤】
1. 按点斜法求LD50或ED50
本法要求剂量按等比级数排列，动物分为4～9组为宜，每组小鼠数相同，通常10只、20只。

每只小鼠给药液容量应合适，一般以0.1～0.2mL/10g体重为宜，药物死亡率大致符合常态分布，不一定出现0％或100％死亡率。

（1）预实验：
1）探索剂量范围：按文献参考值设计，在预实验中先找出100％与0％的致死剂量为实验的上下限剂量（D max和D min）。

实验时可参考表4-1。

100％致死量：全部动物出现死亡的最小剂量。

0％致死量D min：全部动物都不死亡的最大剂量。

本次实验所用盐酸普鲁卡因D max：200 mg/kg, D min:124 mg/kg
2）选择合理的剂量分组方案：组数（G）以4～9组为宜，组间剂量之比值为r。

本次实验G=4，计算r:
r=1.17
根据r值，D max和D min计算出另外两组的剂量：D1=D max=200 mg/kg， D2=D1/1.17=171mg/kg, D3=D2/1.17=145mg/kg, D min=124mg/kg
（2）正式实验：
1）配制等比系列稀释液：每只小鼠给药容量为0.2mL／10g，计算各剂量组的百分浓度。

母液浓度（%）=
注射剂量等容注射量
例如：普鲁卡因母液浓
度（%）＝
200mg/kg
＝
200mg/kg
＝10mg/mL＝1％0.2mL/10g 20mL/kg
计算得： D1（Dmax）:1%, D2: 0.855%, D3:0.725%, D4:0.62%
2）动物分组，编号：取小白鼠称体重，以苦味酸做好标记，随机分组，使各组小鼠体重尽可能均匀一致。

G=4，n=20。

（介绍小白鼠编号方法）
3）给药: 各剂量组给相应浓度盐酸普鲁卡因，0.2ml/10g, i.p。

（介绍小鼠捉拿方法及腹腔注射法）
4）观察记录结果：记录动物死亡数，应观察到动物不再死亡为止，一般观察24h，可根据药物作用快慢，而缩短或延长观察时间。

普鲁卡因观察20分钟即可。

最后将实验结果填入记录表内。

【注意事项】
实验为定量药物效价测定，精确度要求高，在实验过程中各个环节均需准确无误，例如小鼠体重的称量、注射容积的计算及正确的注射方法。

示教小鼠腹腔注射法。

【实验结果】
剂量组死亡率应≤20%。

另外实验结果出现轻微倒置是可能的，但不能相差太大，否则应重做。

根据实验结果计算LD50：点斜计算法。

1）原理：是通过“定点”与“斜率’’来计算回归方程。

定点即是X=log LD50，Y=5之中心点，根据改进并发展了的寇氏面积法求算，点斜法采用近似权重几率单位法求算。

2）点斜法的公式及计算步骤
a．基本公式：
不含0％及100％死亡率的LD50：
LD50＝Log-1 [Xm-i（∑p-0.5）]+i/4（1-P m－P n）
含0％及100％死亡率时的LD50：
LD50＝Log-1 [Xm-i（∑p-0.5）]
b. 其他全部有关公式：
LD50的95％可信限＝Log-1（logLD50±1.96Sx50）
LD50的95％平均可信限值（L95）＝4.513×LD50×Sx50
X m：最高死亡率P m组的对数剂量，
i为组距的对数，
P m为最高死亡率，
P n为最低死亡率（P m与P n可以为100％及0％，亦可不是），
n为组内动物数，G为实验分组数。

【讨论】
应提及LD50的概念、意义及测定方法的选择。

实验结果不出现0%、100%致死量是可能的，但一般最大剂量组死亡率应≥80%，最小剂量组死亡率应≤20%。

可跟据实验结果讨论影响LD50测定的因素，如动物的种类、品系、体重范围、给药途径及观察时间等。

【思考题】
（1）测定LD50与ED5的意义何在？
（2）测定LD50最准确的计算方法是哪一种？点斜计算法的优点有哪些？实验设计要求是什么？。