蛋白质变性与复性

变性可以涉及次级键、 变性可以涉及次级键、二硫键的断裂 但不涉及一级结构上肽键的断裂
蛋白质的变性作用与变构效应有何区别？ 蛋白质的变性作用与变构效应有何区别？ 的变性作用与变构效应有何区别
变性蛋白的特征： 变性蛋白的特征：
a)生物活性丧失， a)生物活性丧失， 生物活性丧失 b)抗原性改变 b)抗原性改变 c)理化性质改变 ： 溶解度下降 （ 沉淀 ） 、 结晶能 c) 理化性质改变： 溶解度下降（ 沉淀） 理化性质改变 力丧失、特性粘度增加、扩散速度下降等。 力丧失、特性粘度增加、扩散速度下降等。 d)生化性质改变： d)生化性质改变：易被蛋白质水解 生化性质改变
（三）蛋白质变性的鉴定方法
观察蛋白质的溶解性是否下降、凝集、 1、观察蛋白质的溶解性是否下降、凝集、 变性 ？ 沉淀
以天然蛋白质作对照， 2、以天然蛋白质作对照，测定蛋白质物理性质的变化 旋光法和圆二色性、紫外差示光谱、 旋光法和圆二色性、紫外差示光谱、 粘度法、 粘度法、电泳法
3、测定蛋白质化学性质的变化 侧链基团与专一试剂的反应性, 侧链基团与专一试剂的反应性,蛋白酶对蛋 白质的水解速度 4、沉淀测定蛋白质（酶）的比活性 沉淀测定蛋白质（ 5、测定蛋白质的抗原性是否改变，抗体能否 测定蛋白质的抗原性是否改变， 与抗原专一性结合
4、表面活性剂的影响
长链脂肪酸或相应的表面活性剂很容易与蛋 白质结合，使蛋白质变性。 白质结合，使蛋白质变性。 特点： 特点：低浓度就能与蛋白质高度结合
如：十二烷基硫酸钠SDS 十二烷基硫酸钠SDS SDS-PAGE中 的作用？ SDS-PAGE中SDS 的作用？
异辛烷基苯氧基多乙氧基乙醇（Triton-100） 异辛烷基苯氧基多乙氧基乙醇（Triton-100）
牛胰核糖核酸酶的变性与复性 （rancreatic ribonuclease)
不少蛋白质的变性之所以不可逆, 不少蛋白质的变性之所以不可逆,主要是所需 条件复杂. 条件复杂. 折叠所需的辅因子 解离与缔合条件的掌握 巯基的保护
(二)蛋白质变性和复性的动力学模型 二 蛋白质变性和复性的动力学模型
二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 可逆体系, 可逆体系,存在平衡
去折叠
N
重折叠
U
1982年邹承鲁对肌酸激酶在盐酸胍 1982年邹承鲁对肌酸激酶在盐酸胍 或脲变性过程中研究的证据指出 蛋白质在折叠与去折叠过程中有相对稳定的中 间体 (I) ,
慢
快
N
I
U
A百度文库凝聚物 包涵体 ) 凝聚物,包涵体 凝聚物
蛋白质复性的意义
重组DNA 重组 目标蛋白质(尿激酶 人胰岛素等) 尿激酶、 →目标蛋白质 尿激酶、人胰岛素等 没有生物活性 (包涵体 包涵体) 包涵体 分离回收包涵体后， →分离回收包涵体后， 溶解包涵体(目标蛋白质恢复应有的天然构象和活 →溶解包涵体 目标蛋白质恢复应有的天然构象和活 性)
（四）各种变性因素对蛋白质构象的影响
1、温度的影响
50℃—60℃的溶液中，蛋白质热变性， 50℃ 60℃的溶液中，蛋白质热变性， 60℃的溶液中
Taq DNA polymerase has a half life at 95℃ of approx. 40 min.
热变性是否可逆？ 热变性是否可逆？ 次级键断裂；二硫键断裂和交换 次级键断裂；
5、有机溶剂的影响 有机溶剂的影响
有机溶剂可以影响静电力，氢键和疏水作用， 有机溶剂可以影响静电力，氢键和疏水作用，导 致蛋白质的构象变化，螺旋度增加。 致蛋白质的构象变化，螺旋度增加。 极性有机溶剂破坏蛋白质的氢键 极性有机溶剂破坏蛋白质的氢键 极性有机溶剂破坏蛋白质疏水作用 非极性有机溶剂破坏蛋白质疏水作用
二、变性蛋白质的复性
（一）可逆变性和不可逆变性 一 不可逆变性： 不可逆变性： 除去变性因素后, 除去变性因素后,蛋白质构象不能由变性态 恢复到天然态的称不可逆变性。 恢复到天然态的称不可逆变性。
可逆变性
除去变性因素后,在适当的条件下, 除去变性因素后,在适当的条件下,该变性蛋白尚能 恢复其天然构象和生物学活性， 恢复其天然构象和生物学活性，这一现象称为可逆 变性又称蛋白质的复性(renaturation) 变性又称蛋白质的复性( 蛋白质的复性
（五）变性蛋白质经过的构象
1、经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 2、经过酸、碱以及热变性的蛋白质，肽链不 经过酸、碱以及热变性的蛋白质， 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 3、由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 变性的蛋白质，螺旋增加， 变性的蛋白质，螺旋增加，不存在疏水键
（二）变性概念
涉及构象变化， 涉及构象变化，二硫键的断裂及侧链基团的化学修饰 吴宪： 吴宪： 天然蛋白质分子从紧密有序的结构 松散无序结构的过程。 松散无序结构的过程。 缺点： 缺点：没有与生物活性的变化联系
由于外界因素的作用， 由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子 构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的丧失以及物理、化学性质的异常变化 ， 的丧失以及物理、 以及物理 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation 。 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。
一些酶低温被钝化，冷钝化是否可逆？ 一些酶低温被钝化，冷钝化是否可逆？ 固氮酶的铁蛋白-----不可逆 固氮酶的铁蛋白-----不可逆 ----丙酮酸羧化酶-----可逆 丙酮酸羧化酶-----可逆 -----
2、酸、碱的影响
在pH4—6范围内，大部分蛋白是稳定的。 pH4 6范围内，大部分蛋白是稳定的。 pH影响肽链中氨基酸残基的解离度， pH影响肽链中氨基酸残基的解离度，从而影响 影响肽链中氨基酸残基的解离度 蛋白质构象
3、变性剂的影响
尿素、盐酸胍， 甲基乙酰胺、 尿素、盐酸胍，N-甲基乙酰胺、甲基胺等 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 有些蛋白质还发生凝集和沉淀 变性机制：破坏氢键？？？ 变性机制：破坏氢键？？？ 用途？ 用途？
蛋白质复性研究的初期成果
单克隆抗体具有协助蛋白质复性的作用 环糊精与直链糊精辅助蛋白质复性 分子伴侣辅助蛋白质复性 人工分子伴侣在蛋白质复性中
6、盐的影响
蛋白质的分离， 蛋白质的分离，提纯 结构与功能的研究中广泛使用 不同的盐对蛋白质的构象有不同的影响
某些离子（ 某些离子（Ca2+,SCN— ）能降低蛋白质构象的 稳定性，也能提高蛋白质的溶解度； 盐溶） 稳定性，也能提高蛋白质的溶解度；（盐溶） 某些离子（ 能提高蛋白质构象的稳定性， 某些离子（SO42-）能提高蛋白质构象的稳定性， 也能降低蛋白质的溶解度（盐析） 也能降低蛋白质的溶解度（盐析） 有些盐对蛋白质作用不大
蛋白质的变性与复性
一、蛋白质变性
（一）为什么要研究蛋白质变性? 为什么要研究蛋白质变性?
三个阶段： 三个阶段：
1、吴宪，变性现象的观察 吴宪， 研究变性与蛋白质分子形状的关系→ 2、研究变性与蛋白质分子形状的关系→ 变性与蛋白质分子构象 研究蛋白质变性和复性的动力学、 3、研究蛋白质变性和复性的动力学、热力学