载体构建基本步骤

载体构建基本步骤

1.选定目的基因，设计特异性引物，利用高保真酶进行PCR扩增

2.对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%）,若检测结果正确，测

序结果之后进行胶回收目的片段

3.通过平末端连接将目的基因连接到克隆载体（PMD-18T）

4.转化DH5α，根据载体抗性涂板37度过夜培养

5.挑取阳性克隆进行PCR验证，PCR验证后挑取阳性克隆进行大摇并

提取质粒、双酶切，同时取500微升菌液送测序

6.测序结果正确后对提取的质粒进行双酶切回收目的片段

7.对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段

8.将目的片段与表达载体的大片段用T4DNA连接酶连接后转化DH5

α，涂板37度过夜

9.挑取阳性克隆大摇酶切验证，若结果正确，则载体构建完毕