GmHSFA1基因克隆及其过量表达提高转基因大豆的耐热性

遗传HEREDITAS(Beijing) 28(11): 1411~1420, 2006研究报告DOI: 10.1360/yc-006-1411

GmHSFA1基因克隆及其过量表达提高

转基因大豆的耐热性

陈晓军1,2, 叶春江1,3, 吕慧颖1, 徐民新1, 李葳1,

张利明1,王超1, 罗淑萍2, 朱保葛1

(1.中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101; 2.新疆农业大学农学院, 乌鲁木齐 830052;

3.济南大学化工学院生物技术系, 济南 250022)

摘要: 热激转录因子在调节植物对逆境胁迫应答和热激蛋白基因表达方面起重要作用。采用生物信息学和比较基因组学方法结合RACE技术从大豆基因组中克隆到一个新的热激转录因子基因GmHsfA1, 其cDNA全长1 781 bp, 包含1个1 533 bp的开放阅读框, 编码含有510个氨基酸残基的蛋白质(GenBank登录号为AY458843)。与其他转录因子的分子结构相似,GmHSFA1也含有4个典型的结构功能域—DNA结合域、寡聚域、核定位信号和C端激活域。

BLAST分析表明, GmHSFA1与其同源性最高的番茄热激转录因子LpHSFA1之间的氨基酸序列相似性为52.46%。

RT-PCR、Northern和遗传转化结果显示: 1)GmHsfA1在大豆的不同组织中呈现组成型表达模式; 2)常温下转基因大豆植株的GmHsfA1表达水平明显高于非转基因对照; 3)GmHsfA1的过量表达激活了转基因大豆植株中热激蛋白基因GmHsp22在非诱导条件下的转录, 并加强了高温胁迫下另2个热激蛋白基因GmHsp23和GmHsp70的表达; 4)转GmHsfA1大豆植株的耐热温度(达52℃)明显高于非转基因植株。上述结果说明, GmHsfA1的过量表达激活或促进其下游3个热激蛋白基因的转录或表达, 明显提高了转基因大豆植株的耐热能力。

关键词: 大豆; 热激转录因子A1(HSFA1); 转基因; 热胁迫; 过量表达; 耐热性

中图分类号:Q943.2 文献标识码: A 文章编号: 0253-9772(2006)11-1411-10 Cloning of GmHSFA1 Gene and its Overexpression Leading to En-hancement of Heat Tolerance in Transgenic Soybean

CHEN Xiao-Jun1,2, YE Chun-Jiang1,3, LÜ Hui-Ying1, XU Min-Xin1, LI Wei1

ZHANG Li-Ming1,WANG Chao1, LUO Shu-Ping2, ZHU Bao-Ge1

(1.Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 2. College of Agronomy, XinJi-

ang Agricultural University, Urmqi 830052, China; 3. BioTech Department, Chemistry-Engineering College, Jinan University, Jinan

250022, China)

Abstract: Heat shock transcription factors (HSFs) are important in regulating heat stress response by mediating expression of heat shock protein (HSP) genes in various plant species. In the present study, a novel GmHSFA1 with an ORF of 1 533 bp (full-length cDNA sequence of 1 781 bp) was cloned from soybean genome via comparative genomic

收稿日期: 2006-02-09; 修回日期: 2006-06-14

基金项目:国家自然科学基金项目、国家重点基础研究发展规划(973计划)项目(编号: 2002CB111304)和国家科技攻关项目(编号: 2004BA525B06)[Supported by the National Natural Science Foundation of China, the Key Project of Chinese National Programs for Funda-mental Research and Development (973 Program) (No.2002CB111304), the National Sci-Tech Project of China(No.2004BA525B06)]

作者简介:陈晓军(1977-), 男, 硕士, 研究方向: 植物基因工程

通讯作者:朱保葛(1960-), 男, 博士, 研究员, 博士生导师, 研究方向:植物遗传学与分子育种。E-mail: bgzhu@

1412 遗传HEREDITAS(Beijing) 2006 28卷

approach and RACE (rapid amplification of cDNA ends). This gene encodes 510 amino acids consisting of a protein of

56.2 kDa (GenBank accession number: AY458843). Similar to other HSFs, GmHSFA1 has the basic modular structure

including DBD, OD, NLS, and CTAD. BLAST analysis revealed the identity of 52.46% between amino acid sequences between GmHSFA1 and LpHSFA1 that has the highest similarity to GmHSFA1 in all HSFA1s in various plant species.

The results from RT-PCR, Northern blotting, and transformation showed: 1) GmHsfA1 exhibited the constitutive expression patterns in different tissues of soybean; 2) The expression level of GmHsfA1 in transgenic plants was notably higher than that in non-transgenic plants; 3) Overexpression of GmHsfA1 activated transcription of GmHSP22 in transgenic plants under normal conditions and enhanced obviously expressions of GmHSP23 and GmHSP70 in transgenic plants under heat stress conditions; 4) Heat tolerant temperature (as high as 52℃) of transgenic plants was remarkably higher than that of non-transgenic plants. These results preliminarily proved that the overexpression of GmHsfA1 possibly led to the notable enhancement of heat-tolerant level of transgenic plants by mediating the activation of transcription or improvement of expression of some GmHSPs in the GmHsfA1’s downstream in transgenic plants, suggesting GmHSFA1 is a novel and functional heat shock transcription factor of soybean.

Key words: Glycine max (L.) Merr; heat shock transcription factor (HSF); transgene; heat stress; overexpression; heat tolerance

热激转录因子(Heat stress transcription factor, HSF)是生物体在热激和其他胁迫条件下基因转录激活信号传导通路中的最后成员, 即直接启动下游热激蛋白基因的表达[1~5]。HSF在调节热激蛋白(Heat shock protein, HSP)基因表达和传递逆境胁迫尤其热胁迫信息以及提高植物耐逆性等方面起着重要作用。HSF是通过结合到热激元件(Heat stress elements, HSE)上激活热胁迫反应的基因, 从而诱导热激反应。

自20世纪80年代后期果蝇(Drosophila melanogaster)HSF基因被首先克隆以来, 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、鸡、番茄、人、水稻、大豆、小鼠、黑猩猩(Pan troglodytes)、海藻(Guillardia theta)、非洲爪蟾(Xenopus Laevis)等物种的HSF基因被相继克隆。HSF蛋白的分子结构具有4个代表性的重要结构功能域: DNA结合域(DNA bind-ing Domain, DBD)、寡聚域(Oligmerization Domain, OD)、核定位信号(Nuclear Localization Signal, NLS)及C端激活域(C-terminal Activation Domain, CTAD), 其中DBD高度保守, 而CTAD的保守性最差[6]。

随着拟南芥基因组测序的完成, 我们能够通过序列比对的手段全面挖掘植物中的热激转录因子家族成员[3]。生物信息学的发展为我们发现和研究新的大豆热激转录因子提供了可能。据报道[6], 拟南芥中发现了21个HSFs; 番茄中发现16种以上的HSFs, 其中HsfA1的克隆和功能研究的比较深入, 认为它在番茄热激响应过程中起主要作用。大豆中也发现了15种以上HSFs的EST序列, 已经克隆了3个大豆HSF基因(GmHsfB4a、GmHsfA2和GmHsfB1)的全长cDNA序列, 但并不包含A1类的HSFs。本研究旨在克隆大豆的HSF A1基因—GmHsfA1, 并研究其表达模式以及对转基因大豆耐热性的作用, 为相关的基础研究和实际应用创造条件。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 植物材料及菌株

实验所用的转化受体材料是本室培育的国审大豆品种科新3号。pBI121-GmHsfA1载体为本实验室构建, 大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌LBA4404及植物表达双元载体pCAMBIA2300均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

SMARTRACE TM cDNA 扩增试剂盒购于BD生物有限公司, TRIZOL试剂盒购于北京博大泰克生物有限公司, pGEM-T载体和RT-PCR试剂盒购于Promega公司。T4DNA连接酶和PCR试剂盒均购自大连宝生物公司, GA、6-BA、IBA、头孢霉素Cef、硫酸卡那霉素(Kana)和乙酰丁香酮(AS)等购于北京博晋生物技术公司。Asp和Glu购于经科宏达生物有限公司, DNA分子量Marker DL2000购于天为时代生物有限责任公司, M-GeneRuler TM 100 bp ladder plus购于上海生物工程有限责任公司。