慢性疼痛基因治疗的研究现状和展望

TR
Transgene cassette
TR
改 造
腺 病 毒 基 因 组
第三代腺病毒生产系统
优点：
病毒载体的优点 增加(36Kb)
Ref：Packer M et al., J Refract Surg. 2002 Nov-Dec;18(6):692-6
定位模糊的伤害性刺激
疼痛上传通路
背根神经节 脊髓背角
脊髓丘脑束
大脑皮层产生感知定位
内源性镇痛系统
内源性镇痛系统： 1、下行抑制旁路：
5－HT; 去甲肾上腺 素纤维对传导疼痛 的上行旁路有一定 抑制作用。
2、内源性吗啡肽：
内啡肽和脑啡肽等 与上行旁路突触周 围的阿片受体结合， 阻断兴奋性递质的 释放，降低痛觉。
腺病毒载体的缺点及改造
缺点：1) 载体容量有限（约8kb)
2)宿主强烈的免疫反应和细胞毒性 3) 基因表达时间短暂 改造方向：
剔除病毒基因组，保留包装所需基因组分，获得的二三代腺病 毒的免疫源性将显著降低，能有效延长目的基因的时效。
通过外壳蛋白改造，使病毒对特异组织的亲和力不断提高,有效 保证转基因的效率。
DNA-
DNA
蛋 白 质 复 合 物
阳 离 子 多 聚 物
嵌 合 物
细胞内包装
细胞外包装
病毒载体系统
优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；
2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。 细胞毒性
存在的问题1、安全性
染色体毒性 免疫毒性 转导靶向性
2、靶向性
转录靶向性
疼痛反应对于生物体和生存是一把 双刃剑，在应激过程中使生物体能够 趋利避害，做出保护自身的反应，而 当疼痛的程度过强或者其持续时间较 长，机体内则将产生一系列反应使机 体的内环境发生变化，而不利于正常 生存。
疼痛治疗的现代观念
疼痛是一种疾病 疼痛永远是恶性的，需要治疗
疼痛是伤害性或潜在组织损伤引起的 不愉快感觉，常伴有内分泌、代谢、 免疫和精神心理改变
转基因蛋白定量检测
大鼠CSF内β-EP含量(pg/ml)
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 注药前 1天 3天 7天 14天 21天 28天 35天 Ad-NEP组 Ad-GFP组
大鼠脑脊液β-内啡肽含量变化趋势
β-内啡肽基因治疗CCI模型
Ad-NEP组 15 吗啡组 Ad-GFP组 生理盐水组
指在末梢的脑、脊神经（或神经 节）、交感神经节等神经内或神经 旁注入药物或以手术物理方法阻断 神经传导功能
需要在短期内重复治疗及影响神经的功能
脊髓刺激
通过放置硬膜外电极，提供电刺激作用 于脊髓后根称脊髓刺激（Spinal Cord Stimulation，SCS）
物理、心理、中医等治疗
解除疼痛的机理尚不十分清楚，疗效不确切
治疗的病人数也有相应增加。从投资来看，除国家投资外，企
业界的热情有增无减，目前每年的总投资在20亿美元左右。这 些都说明基因治疗研究已经以稳健的步伐跨入了二十一世纪！
到2005年1月止基因治疗
迄今共有1020个方案 进入临床试验。其中 方案主要集中在美洲 和欧洲，各有682和 288个。
美国最多，有669个 方案。我国数量较少， 仅有3个方案。
利用整合病毒如AAV和逆转录病毒的相关元件与腺病毒基因组重 组构建的嵌合病毒，有效整合人体染色体，保证目的基因的长期 表达
三代腺病毒载体
第一代：缺失的腺病毒基因片段是E1和/或E3区，属 于一类复制缺陷、非辅助病毒依赖型载体 第二代：在第一代的基础上，用温敏突变子控制E2A 基因产物DBP的表达，进一步缺失E2区和/或E4 第三代：即Gutless Vector, mini-Ad，仅含有病 毒DNA两端的反向末端重复序列，中间夹有 transgene，但至今仍处于研制阶段
虽然使用这些药物和方法确实能产
生好的镇痛效果，但伴随而来的是一些 令人忧虑的副作用
药物治疗给人们和社会带来的后期效果是复杂 的，人们越来越意识到化学药物治疗的缺陷，寻 找一种先进并且治疗效果好的方法是慢性疼痛治 疗中非常迫切的课题。
两种治疗方法的比较
传统药物治疗 使用方便 优 点 效果明确
可多次反复使用，但易发生 不良反应 应用剂量大或多次使用后将 产生戒断症状、耐受、药物 依赖（成瘾）等副作用。 一次应用可长时间镇 痛，作用效果可维持 数十天，甚至数月 少见，多是轻微的感 冒样症状
经组织细胞分化、再生，刺激神经递质释放并 且能改变神经元特性的蛋白分子，包括NT3、 NT4、 BDNF、NGF等。主要是通过抑制神经元凋 亡和促进阿片肽释放治疗疼痛，适用于神经损 伤或中毒导致的慢性神经痛。
免疫调节性细胞因子：IL-2和IL-10。其中
前者主要通过类阿片肽作用，后者通过抑制神 经组织炎症反应达到镇痛目的。
非病毒载体：转染率低，表达不稳定
细胞载体、脂质体、裸DNA、真核表达载体等
基因载体系统
病毒载体系统
非病毒载体系统
反 转 录 病 毒 载 体
腺 病 毒 载 体
腺 相 关 病 毒 载 体
单 纯 疱 疹 病 毒 载 体
慢 病 毒 载 体
DNA阳 离 子 脂 质 复 合 物
DNA-
DNA/RNA
裸
β-内啡肽基因治疗实验报导
1995年Beutle A S.等将小鼠神经生长因子前导 肽与β－内啡肽编码基因的融合，以逆转录病毒 为载体转染NIH3T3 细胞，培养基中可检测到高 浓度的β内啡肽 1999年Alan A. Finegold等 采用这种融合基因 重组的非增殖型腺病毒，大鼠脑脊液内注射后， 三天后脑脊液中的β内啡肽的浓度达到正常大鼠 和人脑脊液中β内啡肽浓度的10-20倍，能够有效 地抑制炎性痛觉过敏 2003年，我们构建携带这种融合基因的腺病毒， 观察到对大鼠坐骨神经痛具有显著的镇痛效果
治疗基因
选择主要集中于抗体、肿瘤抑制剂和细胞因子三个方面。
基因治疗要取得实质性的突破，必须解决三个 关键问题，即基因导入系统、基因表达的可控性 及治疗效果明确的治疗基因。
基因 治疗
基因导 入系统 基因表达 的可控性 治疗效果 明确的基因
慢性疼痛基因治疗可行吗？
答案是肯定的！
单次治疗持续时间显著延长
上调抗痛基因表达
常用目的基因
主要是阿片肽基因
阿片肽
脑啡肽 β - 内 啡 肽μ 强啡肽
受体
δ δ κ ε
基因
已克隆 已克隆 已克隆
镇痛作用
＋＋＋ ＋＋＋ ＋－
基因治疗
＋ ＋ －
孤啡肽
内吗啡肽
ORL
μ
已克隆
未克隆
＋－
＋＋＋＋
－
？
其他目的基因主要是细胞因子
神经营养因子家族：是一类能够促进特定神
脑啡肽基因治疗实验报导
1999年，Eaton M J 等将前脑啡肽原基因构建到 第一代人单纯疱疹病毒基因组中，通过小鼠足底皮 肤注射感染脊髓后角神经元，高效表达的脑啡肽明 显抑制小鼠的冷热刺激痛阈，治疗持续时间达3个 月。
2001年，Braz J等报导用前脑啡肽原基因治疗关 节炎性痛模型。
2003年，Goss J R 等报导重复注射这种基因治 疗系统治疗慢性神经痛模型，并无明显的耐受发生。
大鼠术侧足热痛阈(秒)
12 9 6 3 0 0 7 14 21 28 35
测定时间 (天 )
CCI大鼠转基因治疗热痛阈变化趋势图
常用的转基因载体
病毒载体：转染效率高，转基因表达稳定
单纯疱疹病毒：神经毒性大 腺相关病毒：制备困难，装载容量小，起效慢 逆转录病毒：不能感染非分裂细胞，致畸、成瘤 腺病毒：安全、易制备，宿主范围广，可感染处 于不同 周期的细胞
针对癌症的治疗仍是 基因治疗的首选目标， 但其所占比重相对于 1996年的统计已经有 所下降。
基 因 治 疗 临 床 方 案
采用的基因导入系统
目前在基因治疗中所采用的基因转导系统主要有反转 录病毒载体、腺病毒载体、裸DNA、脂质体和腺相关病 毒载体等，其中腺病毒载体和反转录病毒载体占绝大 部分，分别有 260和261个方案采用，而腺相关病毒载 体只有27个，可能是由于腺相关病毒的生产仍有待突 破。
转导效率
3、有效性
基因表达水平和持续时间
表达的可调控性
腺 病 毒
生物学特性：
双链DNA病毒，优点是能感染分裂和非 分裂细胞，高滴度制备容易，对人体的 毒害作用轻微。缺点是免疫源性强，目 的基因表达时间短。
腺病毒结构
腺病毒基因组示意图
腺病毒转移载体优点
1) 安全
2) 宿主范围广 3) 感染性强 4) 人类蛋白可获得高水平表达 5) 稳定性比较好 6) 易于制备与纯化 7) 制备的病毒滴度高 8) 可通过多种方式到达中枢神经系统
慢性疼痛的基因治疗
研究现状与展望
第二军医大学东方肝胆外科医院
俞卫锋
今日主题
慢性疼痛的概念与机制
寻找慢性疼痛治疗新方法的迫切性
慢性疼痛的基因治疗的研究
基因治疗希望与困难并存
慢性疼痛的概念与机制
定义
慢性疼痛 指在引起急性疼痛
的因素消退以后仍然持续存在的 疼痛，或伴随慢性原始病程产生 的疼痛，诸如创伤或损伤、偏头 痛、各类关节炎、血管神经疾病 和癌症的伴随症状。
内源性基因产物不易耐受成瘾
产物对正常神经系统功能影响小
疼痛基因治疗的策略
上调抗痛基因表达
利用基因重组技术将一些抗痛基因、调控因子基因 及受体基因等外源基因插入载体基因组，加上启动 子，导入神经细胞，促进抗痛基因的表达。
下调疼痛基因表达
降低神经系统内源性疼痛分子的表达，目前基因治 疗 中 常 用 的 knockdown 技 术 有 反 义 寡 核 苷 酸 技 术 ( antisense oligonucleotide,as0DN) 和 RNA 干 扰 (RNAi)。
基因治疗的起始
1989年 美国Rosenberg等经美国FDA批准，进 行了标志基因转移到人体的首次临床 试验。 1990年11月 美国NIH的Blease，Culver和Anderson 进行了首例人体基因治疗的Fra Baidu bibliotek床试验， 并取得了巨大的成功。
基因治疗的研究现状
基因治疗在经历了准备期、狂热期后，从1996年进入了理性 期。美国成立了三个研究基因导入系统与载体的研究机构 ； 从1996 年至今，全世界的基因治疗临床方案增加了数倍，参加
基因治疗
缺
点
慢性疼痛的基因治疗的研究
什么是基因治疗？
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作 用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠 正基因的缺陷，从而达到治疗疾病目的的生 物医学新技术。 DNA
？
疾病
基因治疗的标靶与范围
基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体
细胞和生殖细胞。 目前开展的基因治疗只限于体细胞。基 因治疗目前主要是治疗那些对人类健康 威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血 友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血 症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染 性疾病（如AIDS、类风湿等）。
机体内的某些物质（炎性因子或炎性介质）
过多，不断地刺激产生痛觉的感受器，使人 体感受到痛
癌痛
既有神经性痛也有炎性痛的的特殊类型
疼痛传递的感受
致痛因子如热、冷、机械压力、化学物 质等作用于疼痛感受器（分布于全身的特 殊的感觉神经末梢）。
初级传入神经元
本体觉轻触觉
不同直径的初级传入神经元 伤害刺激和其感受器特异性激活后产生的疼痛信号经过不同的初 定位明确的伤害性刺激 级传入神经传到不同区域的脊髓背角。初级传入神经元有不同的直径， 根据直径的大小可分为三大类，分别传递不同的信息。
疼痛的敏化机制
外周敏化
中 枢 敏 化
癌痛的危害性
全球年新增癌症病例统计
癌症（WHO统计）
60%～90%的晚期癌症患者 有不同程度的疼痛，70%以疼 痛为主要症状 全世界至少有500万人忍受 着癌症疼痛的折磨
我国每年癌症新发病人数约 有180万，其中62％伴有疼痛
晚期有痛病例 43% 早期有痛症状 40%
慢性疼痛
— — 危害性与普遍性
慢性疼痛它不 仅给病患者带来 了难以忍受的痛 苦，同时也给社 会的发展和家庭 的和谐增添了无 形的阻力。已成 为危害公共健康 一大问题。
图.1 慢性疼痛患者百分比
32%
68%
慢性疼痛患者 无疼痛人群
慢性疼痛的分类
神经性痛
传递疼痛信号过于强烈，机体产生不适应
炎性痛
全球年新发癌症患者1000万， 40%伴有不同程度的疼痛；
晚期无痛病例 17%
疼痛不仅是一个医学问题，逐渐变成了一个社会性问题
现有疼痛治疗的局限性
现有药物性、神经阻滞、物理、心理、中医、 手术治疗等治疗方法
药物治疗


非甾体抗炎药（NSAID） 阿片类药物
潜在的心血管风险


耐受与戒断
神经阻滞