人胃癌细胞株MGC_803侧群细胞的分选与生物学特征

人胃癌细胞株MGC-803侧群细胞的

分选与生物学特征

俞薇1，吴婷1，司今2，姜伟2，李锦毅2*

（1辽宁医学院武警总医院研究生培养基地，北京100039；2武警总医院）

摘要：目的从人胃癌细胞株MGC-803中分离侧群（SP）细胞，研究其生物学特征。方法利用流式细胞分选术（FACS）从MGC-803细胞株中分选出SP细胞和非SP细胞亚群进行培养，采用克隆形成实验比较两组亚群细胞的体外增殖能力，NOD/SCID鼠成瘤实验检测两组亚群细胞体内成瘤能力。结果FACS结果显示，细胞株MGC-803中SP细胞亚群占总细胞的0．3% 1．2%；SP细胞体外克隆形成率为（0．862ʃ0．050）%，非SP细胞体外克隆形成率为（0．325ʃ0．207）%，两者比较P＜0．05；SP细胞最低成瘤数量是1ˑ103/只，非SP细胞为5ˑ103/只。结论人胃癌细胞株MGC-803中存在SP细胞，其生物学特性与干细胞基本符合。

关键词：胃肿瘤；干细胞；分离；侧群细胞

中图分类号：R735．2文献标志码：A文章编号：1002-266X（2012）01-0004-03

Isolation and biologic characteristics of the side population in human gastric cancer cell

lines MGC-803

YU Wei1，WU Ting，SI Jin，JIANG Wei，LI Jin-yi

（1Graduate Education Center of Liaoning Medical University in General Hospital of Chinese

People’s Armed Police Forces，Beijing100039，P．R．China）

Abstract：Objective To investigate isolation and biologic characteristics of the side population（SP）in human gas-tric cancer cell lines MGC-803．Methods Fluoresence activated cell sorting was used to sort SP and NSP cells from MGC-803s．Tumorigenicity of the two subpopulations was observed by sphere forming assay．Proliferation was determined by sub-cutaneous tumor formation in NOD/SCID mice．Results The percent of SP cells was0．3%-1．2%．Clone formation effi-ciency of SP cells and NSP cells was（0．862ʃ0．050）%and（0．325ʃ0．207）%respectively，there were significant differ-ences（P＜0．05）．In vivo，the tumorigenic ability of SP cells was higher than that of NSP cells．Tumor formed only by1ˑ103SP cells in nude mice，but5ˑ103NSP cells．Conclusion Human gastric cancer cell lines MGC-803contained some SP cells with stem cell properties．

Key words：stomach neoplasms；stem cells；isolation；side population cells

随着医学水平的进步，胃癌的生存率有所提高，但仍有相当一部分胃癌患者治疗后出现远处转移最终死亡。探索防止胃癌转移的途径是进一步提高胃癌生存率的关键。肿瘤干细胞理论的提出为胃癌的治疗开辟了新的研究方向。研究发现，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中，侧群细胞（SP）具有高增殖和体内高致瘤性等干细胞特性［1 3］。胃癌干细胞的研究国内外报道较少。2010年10月 2011年8月，我们通过分离胃癌SP细胞，对其生物学特征进行初步研究。现报告如下。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81072969）。

*通讯作者1材料与方法

1．1材料人胃癌细胞系MGC-803由中国协和医科大学细胞中心提供。3 4周龄NOD/SCID小鼠32只，购自中国医学科学院动物所。胎牛血清、胰蛋白酶、Hochest33342、PI、DMEM培养液购自美国Sigma公司。主要仪器包括CO

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恒温细胞培养箱、FACS流式细胞仪、倒置显微镜。

1．2方法

1．2．1细胞培养与分选将胃癌细胞置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液中，37ħ、5%CO2、饱和湿度条件下培养，胰蛋白酶消化，常规换液传代。收集对数生

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长期细胞，制成1ˑ106/mL的单细胞悬液，设对照组和实验组，对照组加入维拉帕米。两组分别加入终浓度为5μg/mL的Hoechst33342，37ħ水浴90 min，离心弃上清，PBS冲洗，重悬于含2%胎牛血清的培养基中。检测前10min加入PI至终浓度1μg/mL，去除死细胞，用FACS流式细胞仪分选SP 细胞和非SP细胞，分别接种于细胞培养皿中培养2周，达到再次分析的细胞数目后收集细胞做Ho-echst33342染色，计算SP细胞比例。

1．2．2细胞平板克隆形成实验分别收集分选的SP细胞和非SP细胞，按200个/孔接种于6孔板，设3个平行孔。2周后终止培养，结晶紫染色。显微镜下计数＞50个细胞的克隆数，计算克隆形成率（CFE）：CFE=克隆形成数/接种细胞数ˑ100%。1．2．3体内致瘤性的研究将小鼠随机分成8组各4只。将SP细胞和非SP细胞分别以1ˑ104、5ˑ103、1ˑ103、5ˑ102数量级注射于每组小鼠腋下的同一个位点。每日观察成瘤情况并记录成瘤时间，8周时处死。取瘤体10%甲醛固定，制作小鼠移植瘤石蜡切片，HE染色。

1．2．4统计学方法采用SPSS17．0软件，计量资料以珋xʃs表示，组间比较采用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1流式细胞仪分析结果用FACS检测到胃癌细胞株中存在SP细胞亚群，其占细胞总数的0．3% 1．2%，经维拉帕米阻断后SP细胞亚群减少至0 0．1%。镜下观察分选后的SP和非SP细胞无明显形态学差异。

2．2克隆形成率2周后终止培养，显微镜下可见SP细胞和非SP细胞均有集落形成，SP细胞形成的克隆细胞排列密集且直径较非SP细胞明显增大。两者的CFE分别为（0．862ʃ0．050）%和（0．325ʃ0．207）%，二者比较P＜0．01。

2．3体内致瘤性及病理染色接种SP细胞和非SP细胞到小鼠8周时，各组均未发生意外死亡。各组接种的细胞数和形成的肿瘤数见表1。SP细胞最低成瘤数量是1ˑ103；非SP细胞仅5ˑ103注射组有2只小鼠有肿瘤生长，且成瘤体积小。两者形成肿瘤的组织学结果见图1。

3讨论

Reya等［4］于2001年提出肿瘤干细胞学说，认为肿瘤组织中存在一小部分具有干细胞特性的肿瘤细胞，其具有无限自我更新、高度增殖能力及多向分化潜能，能够产生不同表型的肿瘤细胞，并使肿瘤具

表1各组接种的细胞数和形成的肿瘤数注射细胞数

肿瘤形成数/注射小鼠数

SP细胞非SP细胞5ˑ1020/40/4

1ˑ1031/40/4

5ˑ1034/42/4

1ˑ1044/44/4

SP细胞非SP细胞

图1SP细胞、非SP细胞在小鼠体内形成肿瘤的

组织学结构

有异质性、增殖和浸润等特性。Hoechest33342是一种脂溶性DNA结合荧光染料，某些癌细胞和干细胞可以将其排出细胞，表现为细胞核不着色或者很低程度的着色，利用流式细胞仪可以将不着色细胞加以分离。这种可以排除Hoechest33342的特性称为SP表型，分离出来的细胞称为SP细胞。本研究利用这种原理培养胃癌细胞株分选SP细胞，发现在胃癌MGC-803细胞株中SP亚群占细胞总数的0．3% 1．2%，进一步证实胃癌肿瘤组织中SP细胞亚群的存在。王宁等［5］对胃癌MKN-28肿瘤细胞系SP 细胞亚群初步分析发现，该细胞系SP细胞占细胞总数的0．25%。提示不同肿瘤细胞系中SP细胞亚群的比例存在差异。

肿瘤干细胞是肿瘤研究的热点。干细胞和肿瘤细胞有很多共同点［1］，研究推测胃癌也可能属于干细胞疾病。本研究表明，SP细胞和非SP细胞在形态学上无明显差异，只能从功能学角度鉴定SP细胞的干细胞特性。平板克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，本研究采用克隆形成试验证实SP细胞体外克隆形成能力显著高于非SP细胞。NOD/SCID鼠体内成瘤实验是验证肿瘤干细胞最可靠的指标。本研究发现，SP细胞形成肿瘤所需最低细胞数为1ˑ103，而非SP细胞所需最低细胞数为5ˑ103。以5ˑ103注射SP细胞成瘤率高达100%，而非SP细胞成瘤率仅为50%，SP细胞的致瘤能力显著高于非SP细胞。以上均证实了SP细胞的干细胞样特性。Burkert等［6］从HCG101胃癌细胞株中分选出SP细胞和非SP细胞，分别注射到10只小鼠的皮下，16周后未发现肿瘤生长，这可能与细胞系的选择有关。

干细胞多处于G0期，传统的放疗和化疗治疗恶

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