人胃癌细胞株MGC_803侧群细胞的分选与生物学特征

人胃癌细胞株MGC-803侧群细胞的
分选与生物学特征
俞薇1，吴婷1，司今2，姜伟2，李锦毅2*
（1辽宁医学院武警总医院研究生培养基地，北京100039；2武警总医院）
摘要：目的从人胃癌细胞株MGC-803中分离侧群（SP）细胞，研究其生物学特征。

方法利用流式细胞分选术（FACS）从MGC-803细胞株中分选出SP细胞和非SP细胞亚群进行培养，采用克隆形成实验比较两组亚群细胞的体外增殖能力，NOD/SCID鼠成瘤实验检测两组亚群细胞体内成瘤能力。

结果FACS结果显示，细胞株MGC-803中SP细胞亚群占总细胞的0．3% 1．2%；SP细胞体外克隆形成率为（0．862ʃ0．050）%，非SP细胞体外克隆形成率为（0．325ʃ0．207）%，两者比较P＜0．05；SP细胞最低成瘤数量是1ˑ103/只，非SP细胞为5ˑ103/只。

结论人胃癌细胞株MGC-803中存在SP细胞，其生物学特性与干细胞基本符合。

关键词：胃肿瘤；干细胞；分离；侧群细胞
中图分类号：R735．2文献标志码：A文章编号：1002-266X（2012）01-0004-03
Isolation and biologic characteristics of the side population in human gastric cancer cell
lines MGC-803
YU Wei1，WU Ting，SI Jin，JIANG Wei，LI Jin-yi
（1Graduate Education Center of Liaoning Medical University in General Hospital of Chinese
People’s Armed Police Forces，Beijing100039，P．R．China）
Abstract：Objective To investigate isolation and biologic characteristics of the side population（SP）in human gas-tric cancer cell lines MGC-803．Methods Fluoresence activated cell sorting was used to sort SP and NSP cells from MGC-803s．Tumorigenicity of the two subpopulations was observed by sphere forming assay．Proliferation was determined by sub-cutaneous tumor formation in NOD/SCID mice．Results The percent of SP cells was0．3%-1．2%．Clone formation effi-ciency of SP cells and NSP cells was（0．862ʃ0．050）%and（0．325ʃ0．207）%respectively，there were significant differ-ences（P＜0．05）．In vivo，the tumorigenic ability of SP cells was higher than that of NSP cells．Tumor formed only by1ˑ103SP cells in nude mice，but5ˑ103NSP cells．Conclusion Human gastric cancer cell lines MGC-803contained some SP cells with stem cell properties．
Key words：stomach neoplasms；stem cells；isolation；side population cells
随着医学水平的进步，胃癌的生存率有所提高，但仍有相当一部分胃癌患者治疗后出现远处转移最终死亡。

探索防止胃癌转移的途径是进一步提高胃癌生存率的关键。

肿瘤干细胞理论的提出为胃癌的治疗开辟了新的研究方向。

研究发现，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中，侧群细胞（SP）具有高增殖和体内高致瘤性等干细胞特性［1 3］。

胃癌干细胞的研究国内外报道较少。

2010年10月 2011年8月，我们通过分离胃癌SP细胞，对其生物学特征进行初步研究。

现报告如下。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81072969）。

*通讯作者1材料与方法
1．1材料人胃癌细胞系MGC-803由中国协和医科大学细胞中心提供。

3 4周龄NOD/SCID小鼠32只，购自中国医学科学院动物所。

胎牛血清、胰蛋白酶、Hochest33342、PI、DMEM培养液购自美国Sigma公司。

主要仪器包括CO
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恒温细胞培养箱、FACS流式细胞仪、倒置显微镜。

1．2方法
1．2．1细胞培养与分选将胃癌细胞置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养液中，37ħ、5%CO2、饱和湿度条件下培养，胰蛋白酶消化，常规换液传代。

收集对数生
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长期细胞，制成1ˑ106/mL的单细胞悬液，设对照组和实验组，对照组加入维拉帕米。

两组分别加入终浓度为5μg/mL的Hoechst33342，37ħ水浴90 min，离心弃上清，PBS冲洗，重悬于含2%胎牛血清的培养基中。

检测前10min加入PI至终浓度1μg/mL，去除死细胞，用FACS流式细胞仪分选SP 细胞和非SP细胞，分别接种于细胞培养皿中培养2周，达到再次分析的细胞数目后收集细胞做Ho-echst33342染色，计算SP细胞比例。

1．2．2细胞平板克隆形成实验分别收集分选的SP细胞和非SP细胞，按200个/孔接种于6孔板，设3个平行孔。

2周后终止培养，结晶紫染色。

显微镜下计数＞50个细胞的克隆数，计算克隆形成率（CFE）：CFE=克隆形成数/接种细胞数ˑ100%。

1．2．3体内致瘤性的研究将小鼠随机分成8组各4只。

将SP细胞和非SP细胞分别以1ˑ104、5ˑ103、1ˑ103、5ˑ102数量级注射于每组小鼠腋下的同一个位点。

每日观察成瘤情况并记录成瘤时间，8周时处死。

取瘤体10%甲醛固定，制作小鼠移植瘤石蜡切片，HE染色。

1．2．4统计学方法采用SPSS17．0软件，计量资料以珋xʃs表示，组间比较采用t检验。

P≤0．05为差异有统计学意义。

2结果
2．1流式细胞仪分析结果用FACS检测到胃癌细胞株中存在SP细胞亚群，其占细胞总数的0．3% 1．2%，经维拉帕米阻断后SP细胞亚群减少至0 0．1%。

镜下观察分选后的SP和非SP细胞无明显形态学差异。

2．2克隆形成率2周后终止培养，显微镜下可见SP细胞和非SP细胞均有集落形成，SP细胞形成的克隆细胞排列密集且直径较非SP细胞明显增大。

两者的CFE分别为（0．862ʃ0．050）%和（0．325ʃ0．207）%，二者比较P＜0．01。

2．3体内致瘤性及病理染色接种SP细胞和非SP细胞到小鼠8周时，各组均未发生意外死亡。

各组接种的细胞数和形成的肿瘤数见表1。

SP细胞最低成瘤数量是1ˑ103；非SP细胞仅5ˑ103注射组有2只小鼠有肿瘤生长，且成瘤体积小。

两者形成肿瘤的组织学结果见图1。

3讨论
Reya等［4］于2001年提出肿瘤干细胞学说，认为肿瘤组织中存在一小部分具有干细胞特性的肿瘤细胞，其具有无限自我更新、高度增殖能力及多向分化潜能，能够产生不同表型的肿瘤细胞，并使肿瘤具
表1各组接种的细胞数和形成的肿瘤数注射细胞数
肿瘤形成数/注射小鼠数
SP细胞非SP细胞5ˑ1020/40/4
1ˑ1031/40/4
5ˑ1034/42/4
1ˑ1044/44/4
SP细胞非SP细胞
图1SP细胞、非SP细胞在小鼠体内形成肿瘤的
组织学结构
有异质性、增殖和浸润等特性。

Hoechest33342是一种脂溶性DNA结合荧光染料，某些癌细胞和干细胞可以将其排出细胞，表现为细胞核不着色或者很低程度的着色，利用流式细胞仪可以将不着色细胞加以分离。

这种可以排除Hoechest33342的特性称为SP表型，分离出来的细胞称为SP细胞。

本研究利用这种原理培养胃癌细胞株分选SP细胞，发现在胃癌MGC-803细胞株中SP亚群占细胞总数的0．3% 1．2%，进一步证实胃癌肿瘤组织中SP细胞亚群的存在。

王宁等［5］对胃癌MKN-28肿瘤细胞系SP 细胞亚群初步分析发现，该细胞系SP细胞占细胞总数的0．25%。

提示不同肿瘤细胞系中SP细胞亚群的比例存在差异。

肿瘤干细胞是肿瘤研究的热点。

干细胞和肿瘤细胞有很多共同点［1］，研究推测胃癌也可能属于干细胞疾病。

本研究表明，SP细胞和非SP细胞在形态学上无明显差异，只能从功能学角度鉴定SP细胞的干细胞特性。

平板克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，本研究采用克隆形成试验证实SP细胞体外克隆形成能力显著高于非SP细胞。

NOD/SCID鼠体内成瘤实验是验证肿瘤干细胞最可靠的指标。

本研究发现，SP细胞形成肿瘤所需最低细胞数为1ˑ103，而非SP细胞所需最低细胞数为5ˑ103。

以5ˑ103注射SP细胞成瘤率高达100%，而非SP细胞成瘤率仅为50%，SP细胞的致瘤能力显著高于非SP细胞。

以上均证实了SP细胞的干细胞样特性。

Burkert等［6］从HCG101胃癌细胞株中分选出SP细胞和非SP细胞，分别注射到10只小鼠的皮下，16周后未发现肿瘤生长，这可能与细胞系的选择有关。

干细胞多处于G0期，传统的放疗和化疗治疗恶
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期
性肿瘤主要针对肿瘤中快速增殖的细胞，治疗后仍有相当一部分人出现复发和转移。

针对干细胞的靶向治疗将为延长胃癌患者的生存期甚至治愈胃癌提供可能。

如能杀灭胃癌干细胞或诱导其分化可能解决胃癌术后复发和转移两大问题，对改善预后有重要意义。

参考文献：
［1］Ginestier C，Hur MH，Charafe-Jauffret E，et al．ALDH1is a mark-er of normal and malignant human mammary stem cells and a predic-tor of poor clinical outcome［J］．Cell Stem Cell，2007，1（7）：555-567．［2］王翠环，杜勇瑞，高燕，等．人卵巢癌细胞系干/祖细胞分离及其鉴定［J］．中华肿瘤防治杂志，2010，17（6）：412-416．
［3］王波，杨欢，黄玉政，等．人小细胞肺癌细胞株H446侧群细胞的生物学特征［J］．癌症，2010，29（3）：272-278．
［4］Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al．Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］．Nature，2001，414（6859）：105-111．
［5］王宁，陈凛，卫勃，等．胃癌MKN-28肿瘤细胞系SP细胞亚群初步分析［J］．世界华人消化杂志，2007，15（9）：1000-1003．
［6］Burkert J，Otto WR，Wright NA．Side populations of gastrointestinal cancers are not enriched in stem cells［J］．J Pathol，2008，214（5）：564-573．
（收稿日期：2011-11-13）
·个案报告·
白塞病合并心脏右室肿瘤1例报告
范文强，王文翔，冯俊，侯爱萍
（新乡市中心医院，河南新乡453000）
患者男，29岁。

因口腔溃疡2年，视力模糊1年，阴囊溃疡2个月于2009年9月9日入院。

患者2年前无明显诱因反复出现口腔深大溃疡，无疼痛，服用强的松后好转。

1年前出现左眼视力下降，皮肤间断出现结节性红斑。

2个月前再次出现口腔溃疡，伴结节红斑加重，并出现阴囊深大溃疡。

入院前3d阴囊溃疡出现疼痛，并出现右肩关节肿胀、疼痛，体温升至38．5ħ。

无口干、眼干、脱发、皮疹、光过敏现象，无家族遗传病史。

入院查体：T37．6ħ，BP110/70mmHg。

全身无皮疹、水肿及淋巴结肿大。

心肺听诊无异常。

腹平软，肝脾肋下未及。

四肢肌力、肌张力正常，神经系统查体（－）。

专科查体：右眼视力1．0，左眼视力0．4。

口腔黏膜可见数个直径2 3mm的溃疡，面部痤疮样皮疹。

阴囊处见一5mmˑ4mm大小溃疡，无触痛。

右肩关节皮温增高、肿胀伴压痛，双上肢散在数枚结节样红斑。

针刺反应阳性。

实验室检查：血常规：WBC13ˑ109/L，N85．4%，余正常；尿常规：葡萄糖（+）；ESR 46mm/h，CRP46．2mg/L；肝肾功能未见异常。

尿酸328U/L。

免疫球蛋白：IgG轻度降低，C3轻度增高、C4正常。

抗核抗体、抗ENA抗体、抗CCP抗体等均为阴性。

心电图正常。

胸部CT示右下肺炎症改变。

心脏彩超示右室侧壁27mmˑ19mm等回声，向腔内突出，流出道无明显狭窄，考虑右室侧壁实性占位，纤维瘤或横纹肌瘤可能性大。

腹部超声未见异常。

眼底造影示：左眼后葡萄膜炎。

入院诊断：白塞病（BD）。

予甲强龙针80mg/d注射，3d后改为40mg/d，5d后改为强的松片30mg/d口服。

9月10日加用沙利度胺100mg/d治疗。

9月11日使用地塞米松针5mg隔日球后注射，妥布霉素地塞米松滴眼液及双氯灭痛滴眼液3次/d滴眼。

治疗后患者口腔、外阴溃疡明显好转，关节炎及结节性红斑消失。

复查心脏彩超：右室侧壁见21mmˑ15 mm等回声，估测肺动脉收缩压26mmHg。

患者出院后随访至今，药物逐渐减量，病情平稳。

2010年6月复查，心脏彩超示右室侧壁肿瘤消失。

讨论：BD与自身免疫异常有关，以反复口腔黏膜溃疡、外阴溃疡、皮肤损害和眼病变为主要特征，并可累及关节、肺、中枢和胃肠系统。

心脏也是BD 受累系统之一，称为心脏BD，发病率为1% 5%。

临床表现为瓣膜损害、心绞痛、心包积液、肺动脉高压、心脏血栓、肺栓塞等，并发心脏实性占位较少见。

本例患者除具有BD口腔、眼、生殖器、皮肤病变外，同时伴有肺动脉高压及右室侧壁实性占位，考虑为心脏BD。

心脏彩超显示纤维瘤或横纹肌瘤可能性大，可见丰富血流信号。

经大剂量糖皮质激素、沙利度胺及球后糖皮质激素注射治疗，患者溃疡、眼炎、结节性红斑、关节炎均明显好转，右室肿瘤消失，肺动脉压力下降，说明针对BD的治疗对右室侧壁占位也有疗效。

提示临床对于BD的治疗除神经损害、肠损害、葡萄膜炎外也应重视心脏损害。

（收稿日期：2011-10-13）
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