哺乳动物细胞表达系统
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
因而可通过控制 tet 的浓度来控制基因表达的水平。
▪ 应用于研究基因不同水平的表达对细胞,个体发育的影响
有何不同。
作用机制示意图
四环素调控表达系统构成元件
▪ 四环素阻遏子（Tet repressor protein,TetR） ▪ 四环素操纵子（Tet operator DNA Sequence, TetO） ▪ 单纯疱疹病毒Vp16转录活化区(Vp16 activation domain,AD) ▪ 四环素调控反式激活子（Tetracyeline-Controlled
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规 模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细 胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
已用该细胞株获得了包括人组织纤溶酶原激活剂、生长因 子等在内的多种蛋白的高效稳定表达。
对细胞株选择性地进行遗传改造
基于腺病毒EIA蛋白可反式激活CMV启动子，Cockett等建 立了稳定表达EIA的CHO细胞株，在该细胞中重组前胶原 酶的产量与CHO细胞相比增加了l2倍；该细胞在多种抗体 的表达中亦取得满意的结果。
哺乳动物细胞表达系统在新基因的发现、蛋白质 的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。
研究现状
部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生 产或中试生产阶段。
已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达 和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、 凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、 人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。
哺乳动物细胞表达系统
动物基因工程原理
特点与优势
哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白 质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型 糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分 子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然 的高等生物蛋白质分子。
应用领域
哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物 的生产平台。
转录终止序列
真核基因的hnRNA的加工过程需要PolyA信号,在目的基因 3’端加上PolyA,表达水平提高10倍以上。 SV40的早期和晚期PolyA. 牛生长激素基因PolyA. 人工合成PolyA.
IRES
IRES(internal Ribosome entry site)内部核糖体切入 位点,可从一个mRNA翻译二个ORF。
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
遗传标记 编码产物
筛选药物
wk.baidu.com
作用机理
APH-
氨基糖苷磷酸转移酶 G418
APH灭活G418
DHFR HPHTK-
二氢叶酸还原酶 潮霉素B磷酸转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶
氨甲喋呤 潮霉素B 氨甲喋呤
DHFR变体抗氨 甲碟呤
HPH灭活潮霉素 B
TK合成TMP
XGPRTADA-
黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 霉酚酸 转移酶
内含子
某些内含子有重要的基因功能调控序列,目的基因以基因 组形式克隆入载体能得到高表达。
为增加转录产物的稳定性,表达载体中一般含有天然的或 人工合成的内含子序列。
mRNA前体的剪切能够促进mRNA 从胞核向胞质的运输。 外显子和内含子接头 每个外显子和内含子接头区都有一
段高度保守的一致序列（consensus sequence），即内含子 5’末端大多数是GT开始，3’末端大多数是AG结束，称为 GT-AG法则，是普遍存在于真核基因中RNA的识别信号。
真核表达载体-启动子
构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。
比如由人ubiquitin C启动区序列与CMV增强子组成 的杂合启动子、由SV40早期启动子和人I型T淋巴 细胞病毒LTR中的增强子序列(R-U5片段)组成的 SR-α启动子的活性均与CMV-IE相当；
由鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的 杂合启动子不仅活性比CMV—IE高，而且具有更 为广谱的宿主细胞范围。Novagen公司的pBacMam 表达系统即是以该杂合启动子驱动目的基因的转录。
据报道红细胞生成素启动子在1%氧浓度比在21%氧浓度下活 性增强100倍。这又是一种新的提高表达量的作用机制。
真核表达载体-增强子
常用的增强子有Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人巨 细胞病毒增强子。
James等利用糖皮质类固醇诱导的鼠乳房瘤病毒(MMTV)启 动子和鼠乳房瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR)，在 CHO细胞中表达分泌的碱性磷酸酶，产量为利用常规的 SV40和 CMV启动子的10倍，超过0.4mg/ml。
Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动 子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。
这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。
真核表达载体-启动子
在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录 的基因，如编码红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、血红素加 氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件 (CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导作用因子1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录， 在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。
正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构
上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存 活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有 时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并 无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞 系。
dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当 培养基中逐渐增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对 MTX抗性的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。
据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列 能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
真核表达载体-启动子
外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要 是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。
对细胞株选择性地进行遗传改造
对细胞其它特性的遗传改造，包括细胞生长周期 的调控、细胞的抗凋亡能力、细胞贴壁能力、蛋 白糖基化的模式等方面，亦有相关报道，其实际 应用价值有待得到更多实验数据的支持。
真核表达载体
哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启 动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。
哺乳动物细胞表达系统的表达水平从整个水平上看仍偏低， 一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即130μg/l08细胞/24小时。其限速步骤可能是在工程细胞中重 组蛋白的分泌效率较低。
一、稳定表达细胞系的筛选
构建目的基因的表达载体。 确定受体细胞。 确定筛选方法（抗生素的使用浓度）。 转染后48h,传代铺板 (1 : 100) ,加筛选药物。 3-4d换液1次,直至存活细胞长出岛状细胞簇,约2周。 克隆耐药细胞,检测目基因的存在与表达。
宿主细胞
猴肾细胞（COS）是进行外源基因瞬时表达时用途最广的 宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA 的量或者采用基因组DNA序列的情况都没有什么限制，便 于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快 速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。
宿主细胞
近几年也陆续发现了几种新的有较大应用价值的细胞株：如 来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)。
IRES位于小RNA病毒RNA5’非编码区, 约为450bp。 IRES可与它连接的ORF同时翻译,构建双顺反子和 多顺反子真核表达载体。
分泌表达载体
可调控的哺乳动物细胞表达系统
四环素（tet）调控表达系统
▪ 加入或撤除四环素和四环素衍生物来调控基因表达。 ▪ 外源基因表达的水平与所加的 Tc 浓度在一定范围内相关,
XGPRT和成 GMP
腺嘌呤核苷脱氨酶
腺嘌呤木酮糖苷 ADA-灭活Xyl-A
宿主细胞
常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠 肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨 髓瘤SP2/0细胞等。
不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型 不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。
二、哺乳动物细胞表达系统
(一)宿主细胞 (二)表达载体的构建 (三)表达细胞株的基因共圹增和筛选方法 (四)可调控的哺乳动物细胞表达系统
高等哺乳动物受体细胞
高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞
高等哺乳动物细胞的生长特性
高等哺乳动物受体细胞的条件
以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具 备以下条件： 细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，便于大 规模培养。 遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期 保存。 合适的标记：便于转化株的筛选和维持。 生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。 安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。
启动子和增强子受细胞类型的限制，在不同的细 胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞的类型 选择不同的启动子和增强子以便于目的基因的高 效表达。
目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动 子(CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉 瘤长末端重复序列；Invitrogen公司开发的pcDNA、 pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三种启动子 驱动目的基因的表达。
真核表达载体-启动子
另一类杂合启动子是由活性很低的启动子与数个转录激活 因子结合位点串联而成，这些位点与转录激活因子的结合 受细胞外小分子药物的调控；这类启动子主要用作基因的 诱导表达。
如Invitrogen公司的ecdysone（脱皮激素）诱导表达系统， 其负责目的基因转录的启动子是由热休克蛋白启动子核心 序列(minimal promotor)和5个E/GRE元件组成；
启动子需包含两个识别序列：mRNA转录起始点和TATA 盒。TATA盒位于转录起始位点上游25--30bp处，是引导 RNA聚合酶在正确起始位点转录所必需的序列，即保证转 录的精确起始。其他上游启动子元件常位于TATA盒上游 100~200bp之间，其功能是调节转录的起始频率和提高转 录效率。
真核表达载体-启动子
transactivator .tTA）TetR与Vp16组成融合表达蛋白。
真核表达载体-启动子
近年来又发现了一些新的强启动子，如：人 leukosialin基因启动子和鼠3-磷酸甘油激酶l (PGKI) 基因启动子，活性与CMV-IE相当。
人泛素蛋白(ubiquitin)C基因启动子不仅具有较高 的活性，而且比CMV-IE、PGK1等启动子有更广 泛的宿主细胞范围，几乎在转基因小鼠的所有组 织细胞中都具有较高活性。
原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便 于筛选含重组细菌的抗生素抗性基因，以及便于目的基因 插入的限制性酶切位点。
可视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入位 点等。
真核表达载体
常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶 (dhfr)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶 (cat)基因等
Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现 高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个 克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层 贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。
对细胞株选择性地进行遗传改造
BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白 的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV 早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。
▪ 应用于研究基因不同水平的表达对细胞,个体发育的影响
有何不同。
作用机制示意图
四环素调控表达系统构成元件
▪ 四环素阻遏子（Tet repressor protein,TetR） ▪ 四环素操纵子（Tet operator DNA Sequence, TetO） ▪ 单纯疱疹病毒Vp16转录活化区(Vp16 activation domain,AD) ▪ 四环素调控反式激活子（Tetracyeline-Controlled
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规 模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细 胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
已用该细胞株获得了包括人组织纤溶酶原激活剂、生长因 子等在内的多种蛋白的高效稳定表达。
对细胞株选择性地进行遗传改造
基于腺病毒EIA蛋白可反式激活CMV启动子，Cockett等建 立了稳定表达EIA的CHO细胞株，在该细胞中重组前胶原 酶的产量与CHO细胞相比增加了l2倍；该细胞在多种抗体 的表达中亦取得满意的结果。
哺乳动物细胞表达系统在新基因的发现、蛋白质 的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。
研究现状
部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生 产或中试生产阶段。
已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达 和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、 凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、 人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。
哺乳动物细胞表达系统
动物基因工程原理
特点与优势
哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白 质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型 糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分 子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然 的高等生物蛋白质分子。
应用领域
哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物 的生产平台。
转录终止序列
真核基因的hnRNA的加工过程需要PolyA信号,在目的基因 3’端加上PolyA,表达水平提高10倍以上。 SV40的早期和晚期PolyA. 牛生长激素基因PolyA. 人工合成PolyA.
IRES
IRES(internal Ribosome entry site)内部核糖体切入 位点,可从一个mRNA翻译二个ORF。
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
遗传标记 编码产物
筛选药物
wk.baidu.com
作用机理
APH-
氨基糖苷磷酸转移酶 G418
APH灭活G418
DHFR HPHTK-
二氢叶酸还原酶 潮霉素B磷酸转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶
氨甲喋呤 潮霉素B 氨甲喋呤
DHFR变体抗氨 甲碟呤
HPH灭活潮霉素 B
TK合成TMP
XGPRTADA-
黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 霉酚酸 转移酶
内含子
某些内含子有重要的基因功能调控序列,目的基因以基因 组形式克隆入载体能得到高表达。
为增加转录产物的稳定性,表达载体中一般含有天然的或 人工合成的内含子序列。
mRNA前体的剪切能够促进mRNA 从胞核向胞质的运输。 外显子和内含子接头 每个外显子和内含子接头区都有一
段高度保守的一致序列（consensus sequence），即内含子 5’末端大多数是GT开始，3’末端大多数是AG结束，称为 GT-AG法则，是普遍存在于真核基因中RNA的识别信号。
真核表达载体-启动子
构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。
比如由人ubiquitin C启动区序列与CMV增强子组成 的杂合启动子、由SV40早期启动子和人I型T淋巴 细胞病毒LTR中的增强子序列(R-U5片段)组成的 SR-α启动子的活性均与CMV-IE相当；
由鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的 杂合启动子不仅活性比CMV—IE高，而且具有更 为广谱的宿主细胞范围。Novagen公司的pBacMam 表达系统即是以该杂合启动子驱动目的基因的转录。
据报道红细胞生成素启动子在1%氧浓度比在21%氧浓度下活 性增强100倍。这又是一种新的提高表达量的作用机制。
真核表达载体-增强子
常用的增强子有Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人巨 细胞病毒增强子。
James等利用糖皮质类固醇诱导的鼠乳房瘤病毒(MMTV)启 动子和鼠乳房瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR)，在 CHO细胞中表达分泌的碱性磷酸酶，产量为利用常规的 SV40和 CMV启动子的10倍，超过0.4mg/ml。
Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动 子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。
这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。
真核表达载体-启动子
在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录 的基因，如编码红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、血红素加 氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件 (CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导作用因子1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录， 在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。
正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构
上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存 活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有 时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并 无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞 系。
dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当 培养基中逐渐增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对 MTX抗性的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。
据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列 能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
真核表达载体-启动子
外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要 是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。
对细胞株选择性地进行遗传改造
对细胞其它特性的遗传改造，包括细胞生长周期 的调控、细胞的抗凋亡能力、细胞贴壁能力、蛋 白糖基化的模式等方面，亦有相关报道，其实际 应用价值有待得到更多实验数据的支持。
真核表达载体
哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启 动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。
哺乳动物细胞表达系统的表达水平从整个水平上看仍偏低， 一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即130μg/l08细胞/24小时。其限速步骤可能是在工程细胞中重 组蛋白的分泌效率较低。
一、稳定表达细胞系的筛选
构建目的基因的表达载体。 确定受体细胞。 确定筛选方法（抗生素的使用浓度）。 转染后48h,传代铺板 (1 : 100) ,加筛选药物。 3-4d换液1次,直至存活细胞长出岛状细胞簇,约2周。 克隆耐药细胞,检测目基因的存在与表达。
宿主细胞
猴肾细胞（COS）是进行外源基因瞬时表达时用途最广的 宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA 的量或者采用基因组DNA序列的情况都没有什么限制，便 于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快 速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。
宿主细胞
近几年也陆续发现了几种新的有较大应用价值的细胞株：如 来源于MadIin-Darby犬肾的高分化内皮细胞株(MDCK)。
IRES位于小RNA病毒RNA5’非编码区, 约为450bp。 IRES可与它连接的ORF同时翻译,构建双顺反子和 多顺反子真核表达载体。
分泌表达载体
可调控的哺乳动物细胞表达系统
四环素（tet）调控表达系统
▪ 加入或撤除四环素和四环素衍生物来调控基因表达。 ▪ 外源基因表达的水平与所加的 Tc 浓度在一定范围内相关,
XGPRT和成 GMP
腺嘌呤核苷脱氨酶
腺嘌呤木酮糖苷 ADA-灭活Xyl-A
宿主细胞
常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠 肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨 髓瘤SP2/0细胞等。
不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型 不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。
二、哺乳动物细胞表达系统
(一)宿主细胞 (二)表达载体的构建 (三)表达细胞株的基因共圹增和筛选方法 (四)可调控的哺乳动物细胞表达系统
高等哺乳动物受体细胞
高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞
高等哺乳动物细胞的生长特性
高等哺乳动物受体细胞的条件
以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具 备以下条件： 细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，便于大 规模培养。 遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期 保存。 合适的标记：便于转化株的筛选和维持。 生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。 安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。
启动子和增强子受细胞类型的限制，在不同的细 胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞的类型 选择不同的启动子和增强子以便于目的基因的高 效表达。
目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动 子(CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉 瘤长末端重复序列；Invitrogen公司开发的pcDNA、 pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三种启动子 驱动目的基因的表达。
真核表达载体-启动子
另一类杂合启动子是由活性很低的启动子与数个转录激活 因子结合位点串联而成，这些位点与转录激活因子的结合 受细胞外小分子药物的调控；这类启动子主要用作基因的 诱导表达。
如Invitrogen公司的ecdysone（脱皮激素）诱导表达系统， 其负责目的基因转录的启动子是由热休克蛋白启动子核心 序列(minimal promotor)和5个E/GRE元件组成；
启动子需包含两个识别序列：mRNA转录起始点和TATA 盒。TATA盒位于转录起始位点上游25--30bp处，是引导 RNA聚合酶在正确起始位点转录所必需的序列，即保证转 录的精确起始。其他上游启动子元件常位于TATA盒上游 100~200bp之间，其功能是调节转录的起始频率和提高转 录效率。
真核表达载体-启动子
transactivator .tTA）TetR与Vp16组成融合表达蛋白。
真核表达载体-启动子
近年来又发现了一些新的强启动子，如：人 leukosialin基因启动子和鼠3-磷酸甘油激酶l (PGKI) 基因启动子，活性与CMV-IE相当。
人泛素蛋白(ubiquitin)C基因启动子不仅具有较高 的活性，而且比CMV-IE、PGK1等启动子有更广 泛的宿主细胞范围，几乎在转基因小鼠的所有组 织细胞中都具有较高活性。
原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便 于筛选含重组细菌的抗生素抗性基因，以及便于目的基因 插入的限制性酶切位点。
可视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入位 点等。
真核表达载体
常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶 (dhfr)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶 (cat)基因等
Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现 高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个 克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层 贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。
对细胞株选择性地进行遗传改造
BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白 的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV 早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。