第六讲致突变作用

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⑤ 自发回变数测定：受试菌株在保存或培养 过程中，能产生自发回变。 v 不 同 菌 株 的 自 发 回 变 数 有 一 定 范 围， T A97( 9 0 ~ 1 8 0 ) 、 T A98( 1 5 ~ 6 0 ) 、 TA100(75~200)、TA102 (240~360)。 v 鉴 定方法：取受试菌株新鲜培养液加到顶层 琼脂中，摇匀，迅速倾入底层葡萄糖平皿上， 培养48小时，计数自发回变菌落数。
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突变的不良后果
突变的不良后果
体细胞突变
生殖细胞突变
癌 变
致 畸衰 老Biblioteka 21配 子 死 亡
死 胎
自 发 流 产
先 天 畸 形
药物致突变作用的检测方法
z 用 短期致突变试验来预测化学物质潜在致癌性 的设想，自70年代以来逐步得到证实，并为世 界所公认。据不完全统计，70年代发展和建立 起来的短期致突变方法多达100多种，但均各有 优缺点，需要不同检测方法的互相补充和引证。 z 选 择短期致突变试验的原则：方法应简单、经 济、快速和易于重复，在一定允许范围内的假 阴性和假阳性，敏感性高，敏感谱广。 z 主 要采用体外测试系统，再适当结合体内测试 系统的原则。
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④ R因子的鉴定：带有R因子的菌株具有抗氨 苄 青 霉 素 的 特 性 ， 据 此 以 鉴 别 R 因 子 之 存 在， TA102菌株含PAQ1质粒（含抗四环素因子）。 v 鉴定方法：在琼脂平皿上滴加氨苄青霉素溶液， 不含R因子的菌株在氨苄青霉素周围有一生长 抑制区，含R因子的菌株因具有抗氨苄青霉素 的作用，故无抑制区。 v 同法滴加四环素溶液，可鉴定PAQ1质粒。
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致突变作用的类型
（2）颠换型突变（transversion）： ª 指DNA多核苷酸链上的碱基中，嘌呤取代嘧啶 或嘧啶取代嘌呤所引起的突变。结果也是多肽 链中一个氨基酸的变更。 ª 一些烷化剂如二乙基亚硝胺等可引起这种突变。
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基因突变(gene mutation)
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n n
2.移码突变(frameshift mutation) ： 指DNA多核苷酸链上碱基序列中丢失一个或 几个碱基，或插入一个或几个化合物分子， 结果使突变位点以下的碱基序列发生变更， 以致使三联密码转录和翻译时，发生较多遗 传信息的改变。 多环芳香烃类、芳香胺类、嘧啶类化合物和 黄曲霉素B1等都能引起插入型移码突变。
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② 深粗糙型（rfa）鉴定（结晶紫抑菌试验）深 粗糙型突变的细菌，缺乏脂多糖屏障，大分子物 质能进入菌体。 鉴定方法：于琼脂平皿上滴加0.1%结晶紫溶 液，竖起平皿，让结晶紫溶液顺平皿流下。在与 结晶紫溶液流下的方向垂直划线接种试验菌株。 培养24～48小时，观察生长情况。在结晶紫溶液 渗透区出现抑菌，证明试验菌株有 rfa 突变存在， 意味结晶紫大分子进入菌体并杀死细菌。
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v T A 97 、 TA 98 和 TA 100 菌株均有切除修复突变， 即ΔuvrB; v 四种标准菌株均有深粗糙型突变, 即rfa突变; v 四 种标准菌株均有 R 因子，对氨苄青霉素具有 抗药性; v TA102菌株还有PAQ1质粒，对四环素具有抗药 性。
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v △uvrB：紫外线抗性基因突变―细菌失去对 紫外线损伤的修复能力； v rfa：深粗糙型基因突变―细胞壁脂多糖的性 质改变，丧失屏障作用，使许多物质渗入细 胞中； v R因子质粒PKM101－增加细菌的易错误修复 系统
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v 对照组
v 用溶媒作阴性对照，已知致突变原作阳性对照。 v 对 需使用间接诱变物作对照时，应注意平行设 加S9与不加S9的对照，以证实其为间接诱变物。
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试验方法
（1）掺入法：将测试菌液0.1ml、测试样品0.1ml 和S9混合液0.5ml加入顶层琼脂中，充分混匀后迅速 倾入葡萄糖琼脂底层培养基平皿上。琼脂凝固后将 平皿放入37℃培养箱，2天后计数测试平皿和对照平 皿的菌落数。如菌落太小，可继续培养到72小时观 察结果。
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菌株鉴定
① 组氨酸营养缺陷鉴定：组氨酸营养缺陷型 菌株只能在补充有组氨酸的培养基上生长，而 在无组氨酸的培养基上则不能生长。 v 鉴 定方法：取两组底层葡萄糖平皿，其中一 组于平板表面涂加组氨酸和生物素，另一组 （对照）仅加生物素。 v 将 试验菌株在此两组培养基上划线接种，培 养24～48小时，对照平皿无细菌生长，含组 氨酸平皿有细菌生长。
第六讲 致突变作用的研究 及其试验方法
遗传毒理学
1. 基本概念 2. 化学毒物致突变的类型 3. 突变作用的后果 4. 致突变作用的检测方法
基本概念
z 突变(mutation) 遗传结构本身的变化及其引起的变异称为突变， 突变实际上是遗传物质的一种可遗传的变异。 z 自发突变(spontaneous mutation) 由于自然界中诱变剂的作用或由于偶然的自制、 转录、修复时的碱基配对错误所产生的突变。 z 诱发突变(induced mutation) 在诱变剂的作用下发生的突变。
n
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致突变作用的类型
二、染色体畸变(chromosome aberration)
v 1. 染色体数目的畸变：正常的生殖细胞染色体
为单倍体(haploid), 体细胞为双倍(diploid)。在突 变细胞中，染色体成整倍地发生变化，以致形 成三倍体(triploid)、 四倍体(tetroploid)…，二 倍体以上统称为多倍体（polyploid）。 v 在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有 三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞的整倍体 改变，几乎都是致死性的。如秋水仙碱可引起 这种突变。
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突变的物质基础
­ 基因是DNA分子上最简单而又完整的功能单位， 每一个基因产生一种功能产物，几乎所有的基 因功能产物都是多肽 ( 蛋白质 ) 。一个基因在伸 直的DNA链上约有500～1000个碱基对。 ­ 染色体由成千上万个基因组成，它以一定的形 式和位置排列在染色体上。
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DNA与基因
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四种标准试验菌株的基因型和自发回变鉴定
菌株 TA97 TA98 TA100 TA102 野生型 组氨酸 需要① + + + + rfa突变 ② + + + + uvrB缺 失③ + + + R因子 自发回变 ④ 菌落数 + + + + 90～180 15～60 75～200 240～360
注：①“+”表示需要；②“+”表示抑菌圈；③“+”表 示无修复能力；④“+”表示具有 R因子 35
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③ uvrB缺失的鉴定（紫外线敏感试验）uvrB 缺失，即切除修复系统缺失，此特性一般较稳定， 不易丢失。 v 鉴定方法：将受试菌液在琼脂平皿上划线。用 黑纸覆盖培养皿的一半，然后在紫外线灯下照 射，培养24小时。如果经紫外线照射部分无细 菌生长，而覆盖的一半有细菌生长，则说明对 紫外线敏感，亦即此菌株具有 uvrB 缺失的特 性。
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染色体畸变
环 状 染 色 体
双 着 丝 点 染 色 体
倒 位
易 位 (inversion)
插 入 和 重 复 (translocation)
辐 射 体
缺断 失片
微 小 体
无 着 丝 点 环
(minute body) (fragment) (deletion) (break) 和
裂 隙
断 裂
(gap)
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原理：
v 利用组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌突变株为 测试指示菌，观察其在某受试物作用下回复突 变为野生型的一种测试方法。
鼠伤寒沙门氏 菌野生型(his+) 正向突变 回复突变 组氨酸营养缺陷型 突变株(his )
代谢活化系统 受试物
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推荐使用的菌株:TA97、TA98、TA100和TA102 四种标准菌株。 v TA97和TA98检测移码突变； v TA100检测碱基置换突变； v TA102检测碱基置换和移码突变。
染色体
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突变作用
z 突变作用 (mutagenesis)
生物体遗传物质发生急剧的遗传学变化，导致 可遗传的表型变异，其表型变异为不可逆的，这 种现象称为突变作用。 突变作用可视为DNA结构在任一水平上受到破 坏，并由此造成了体细胞或生殖细胞中的遗传信 息的改变。 广义地包括基因突变和染色体畸变。
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染色体缺失及环状染色体的形成图
染色体插入和重复示意图
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染色体的臂间倒位
染色体相互易位示意图
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致 突 变 物
z 凡 能引起生物体发生突变的药物为药物致突 变物(drug mutagen)。 z 具 有很高化学活性的外源化合物，其原形就 可引起生物体的突变，称为直接致突变物 (direct mutagen) 。 z 本 身不引起突变，必须在体内经过代谢活化 后才具有致突变作用的外源化合物，则称为 间接致突变物(indirect mutagen)。
剂量设计
v 决定受试物最高剂量的标准是药物对细菌的毒 性和溶解度。化药一般最大剂量可达５ mg/ 皿， 中药可超过５mg/皿，最低剂量一般１µg/皿或 0.1µg/皿。受试物至少应有五种不同剂量。 v 受 试 物 如 不 溶 于 水 ， 可 用 二 甲 基 亚 砜 （DMSO）或乙醇作溶剂，DMSO用量每皿不 超过0.5ml，乙醇不超过0.1ml。
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v 染色体数目也可以不成整倍地增减，即形成非 整倍体（aneuploid），如染色体数目超过二倍 体，即为超二倍体（hyperdiploid）, 少于二倍 体则为亚二倍体（hypodiploid）。 v 染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可 能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。 如21-三体导致先天愚型(Down氏综合征)，是 最常见的染色体非整倍体疾病。
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致突变作用的类型
v 2. 染色体结构的畸变：在诱变因素作用下， 染色体从长轴上断下一个断片，叫做断裂 （break）, 这是造成染色体结构变化的根本 原因，根据断片不同的重接方式，形成四种 畸变：
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（1）缺失（deficiency）: 即染色体的断片未与 断裂端连接。因此，失去一个片断及其所携带 的遗传密码。 （2）重复（duplication）: 即断片与同源染色 体连接，使一部分遗传密码重复出现。 （ 3 ）倒位（ inversion ） : 断片作 180 O 倒转后， 再接到断端上。 （4）易位（translocation）: 两条非同源染色 体同时断裂，两个断片交换位置后相接。
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一、微生物回复突变试验 (Ames试验) ：
由美国加州大学伯克利分校生化教授 Ames（1972）首创。 目前公认Ames试验作为筛选可能有致突变 作用的化学物，是一种可靠的方法。
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z 优点： 1.可用来作为诱变指示物的微生物有噬菌体、 细菌和真菌等。 2.微生物具有繁殖快、个体数量多、容易观察 检出等特点，而且方法较为敏感、检出率较高、 试验周期短、费用也较低。
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缺点： 1.微生物是单细胞生物，与哺乳动物及人类有 较大的差别，例如核结构不同、DNA裸露而且 数量少、分子小、对化学诱变原不能进行代谢 活化或降解以及缺乏免疫系统等。 2.有些受试物，在体外并不直接具有致突变性， 而在体内形成的代谢产物却具有致突变作用,就 会得出“假阴性”的结论。相反，某些在体外 实验中可引起微生物发生突变作用的受试物， 在体内经代谢后可失去其原有的致突变性，以 至出现“假阳性”的结果。
致突变作用的类型
一、基因突变(gene mutation)
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1．点突变(point mutation)：即碱基取代型 突变。
（1）转换型突变（transition）：指DNA多 核苷酸链上的碱基中，嘌呤互相取代（鸟嘌 呤置换腺嘌呤或相反）或嘧啶互相取代（胞 嘧啶取代胸腺嘧啶或相反）所引起的突变。 DNA 转录时可引起一个 RNA 密码子的改变， 在翻译时可使多肽链中的一个氨基酸发生变 更。如亚硝酸可引起这种突变。
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致突变作用的类型
v 基因突变（gene mutation） 外源化合物对遗传物质的影响仅涉及某一部分， 如三联密码中碱基对的改变或基因中密码的改变， 使基因的功能产物发生变化称为基因突变。 v 染色体畸变（chromosome aberration） 外源化合物对遗传物质的影响涉及到整个染色体， 表现为染色体结构与数目的变化称为染色体畸变。