免疫细胞分离

（三）T细胞介导的细胞毒试验
1.原理：
靶细胞抗原
CTL细胞 靶细胞
致敏CTL
靶细胞被破坏和溶解
2.方法
➢ 形态学方法：CTL细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞 ➢ 51Cr释放法 ：淋巴细胞（CTL）+51Cr标记的肿瘤细胞
51Cr 释放 测定γ射线
意义： 肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力
T细胞细胞毒性试验示意图
➢ B1细胞与机体的免疫调节、自身免疫病有关；B2 细胞主要是外周成熟的B细胞，执行体液免疫的主 要细胞。
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以CD16、 CD56来认定，临床上将CD3CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。
四、淋巴细胞表面标志的检测
间接荧光免疫法 酶免疫组化法 流式细胞技术
二甲基亚砜
溶解
试验孔A
均值
SI
570nm
对照孔A
均值
570nm
A570比色，颜色深浅反映细胞增殖水平
(二) T细胞分泌功能测定
体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激 后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物 学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、 生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。
第十三章 免疫细胞分离与免 疫细胞功能检测及应用
温州医科大学检验医学院 林向阳
内容提要
第一节 免疫细胞的分离 第二节 淋巴细胞表面标志及亚群分类 第三节 抗原提呈细胞表面标志的检测 第四节 淋巴细胞的功能检测 第五节 其他免疫细胞功能检测技术 第六节 免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用
免疫细胞: 即参与免疫应答的细胞
第三节 抗原提呈细胞表面标志的检测
➢抗原提呈细胞（APC)指能摄取、加工、处理抗原， 并提呈抗原给淋巴细胞的一类免疫细胞。
➢专职APC:巨噬细胞、树突状细胞、B细胞等 ➢非专职APC:包括内皮细胞、上皮细胞和激活的T细 胞
CD14
CD1a CD11c CD83
CD19 CD20
பைடு நூலகம்
第四节 淋巴细胞功能检测
淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体 内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有 丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对 抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验 及淋巴细胞分泌产物的测定.
淋巴细胞
➢T细胞（负责细胞免疫功能） ➢B细胞（执行体液免疫功能） ➢NK细胞（非特异性免疫作用）
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞 过渡型
12～20
12～16
增大、疏松
增大、疏松
清晰、1～4个
有或无
有或无
无
增多、嗜碱
增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
方法学评价：
➢优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能 观察结果，适于基层实验室应用。 ➢缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受 主观因素影响，重复性和准确性较差。
➢反映机体免疫功能状态。 ➢肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。 ➢组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测有利 于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。
思考题
1.免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分离纯化？ 2.淋巴细胞有哪几类细胞？能用形态学的方法加以区别吗？ 3.将细胞分离的方法有哪些？各有什么特点？ 4.T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞的主要生物标志是什么？ 5.细胞表面标志的检测方法有哪些？ 6.淋巴细胞功能检测的方法及临床意义？ 7.吞噬细胞的功能检测方法?
特异性刺激物： 破伤风类毒素 纯化蛋白衍生物（PPD) 白色念珠菌等
3. 检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
（1）形态学检查法
刺激物 淋巴细胞（72 h） 母细胞化
转化率
转化的淋巴细胞数
100%
转化和未转化的淋巴细 胞数
细胞大小(直径μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
1.原理：
2．应用与方法学评价：
➢该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体 分泌量。 ➢优点：
稳定、特异、抗原用量少；可定量
三、NK细胞活性测定
➢形态法 ➢酶释法 ➢同位素法
台盼蓝染色计数
靶
细 离心取上清
胞
测LDH
溶 测CPM值 解
常用靶细胞: K562细胞株用于测定人NK细胞
第五节 其他免疫细胞功能检测
操作
甲赞(蓝黑色颗粒)
抗凝血+NBT应用液 温育 推片 瑞士复染
意义 慢性肉芽肿患者 NBT阳性细胞下降
二、巨噬细胞功能检测
人巨噬细胞：用斑蟊敷贴法收集 鼠巨噬细胞：从腹腔渗出液获得
(一)吞噬功能检测
巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬 功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵 母细胞等作为吞噬颗粒。
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红 细胞受体是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
➢ B细胞表面较特异的CD分子有CD19、CD20、 CD21、CD22、CD23等
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2 细胞，为CD19+CD5+,而B2细胞为CD19+CD5-。
➢ CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell, Tc ） CD3CD8CD30-为Tc1, CD3CD8CD30+为Tc2
➢ 调节性T细胞: （regulatory T cell, Tr or Treg） 典型的标志为CD4+CD25+Foxp3+
二、B细胞表面标志
吞噬率(%) 吞噬细菌的白细胞数 100 计数的白细胞数
杀菌率(%) 胞内含着染菌体的细胞 数 100 计数的白细胞数
2. 溶菌法
杀菌率(%) （1 作用30、60或90 min 菌落数 ） 100 0 min 菌落数
3．NBT (硝基四氮唑蓝)还原试验
原理
中性粒细胞杀菌 耗能
四氮唑蓝(淡黄色) 代谢 生成H+
（2）3H-TdR掺入法
PHA 淋巴细胞（54h）
DNA合成期 + 3HTdR掺入
收集细胞
检测β射线
测定细胞内的3H－TdR
➢优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 ➢缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。
（3）MTT比色法
• 刺激物 淋巴细胞
MTT
甲赞（蓝黑色颗粒）
(二)巨噬细胞溶酶体酶的测定
1．酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法
2．非特异性酯酶的测定 常用α-萘醋酸法
(三) 巨噬细胞促凝血活性测定
激活的巨噬能分泌V, VII, IX, X, 凝血酶原 等凝血因子
正常兔血浆+CaCl2 激活的巨噬细胞(试管)
血浆凝固时间
第六节 免疫细胞表面标志和功能检测 的临床应用
分离液的要求：等渗、密度 1.077±0.002
用1.077±0.002的分层液可将细胞分离
操作步骤
稀释 加样 离心 吸取 洗涤 计数
二 、淋巴细胞分离
（去单核细胞）
➢ 贴壁粘附法 ➢ 吸附柱过滤法 ➢ Percoll 分离液法
（连续密度梯度离心）
percoll分层液法
Percoll原液：经聚乙烯吡咯烷酮PVP处理的硅胶颗粒 磷酸盐缓冲液 • 原理：利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密 度梯度，将密度不同的细胞分离纯化。 • 特点：等渗、粘度低、无毒性、不引起细胞聚集
第二节 淋巴细胞表面标志检测及亚群分类
常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志 是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。
一、T细胞表面标志及其亚群
➢ CD3分子是T细胞共同的标志性抗原。外周血中成熟 的T细胞主要是TCRαβT细胞。
➢ CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell, Th） CD3CD4CD30-为Th1, Th1分泌IL-2，IFN- ᵧ等 CD3CD4CD30+为Th2，Th2分泌IL-4，IL-5，IL-6等
脾
B
补体
被 动 溶 血 空 斑 试 验 ： 指 抗 体 形 成 细 胞 产 生 的 Ig 与
SRBC上的抗原结合，在补体参与下发生溶血
B
Ag
补体
临床应用与评价
➢溶血空斑试验主要用于测定药物和手术 等因素对体液免疫功能的影响 ➢评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗 体的能力。
(二)B细胞抗体形成功能的检测 ——酶联免疫斑点法（ELISPOT）
➢ 外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells, PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞
（monocyte）。 ➢ Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种密度梯度离心的分离法。
不同细胞密度不同
➢人的红细胞:1.093;粒细胞:1.092 ➢血小板: 1.030-1.035 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
操作步骤
• 制备连续密度梯度分离液 • 单个核细胞铺于分离液面 离心分钟
评价： 淋巴细胞纯度可高达98％ 纯化单核细胞和淋巴细胞 操作流程较长, 手续较多
三、 T、B和T细胞亚群的分离
➢磁性微球分离法 ➢荧光激活细胞分离仪分离法
免疫磁珠法细胞分选过程
荧光激活细胞分离仪分离法
全自动细胞分选系统
吞噬细胞的吞噬活动分为趋化、吞噬和胞内杀伤 作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。
一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术
一、中性粒细胞功能的检测
➢ 趋化功能的检测 ➢ 吞噬和杀菌功能的检测
(一) 趋化功能检测
滤膜渗透法（Boyden 小室法）
琼脂糖平板法
(二)吞噬和杀菌功能测定 1．显微镜检查法：
(四) 体内试验
常用于诊断某些病原微生物感染和细胞免 疫缺陷等疾病
➢特异性抗原皮肤试验：OT试验
➢PHA皮肤试验 ：非特异性激活淋巴细胞
二、B细胞功能检测
➢B细胞增殖能力的试验 ➢溶血空斑试验 ➢B细胞抗体形成功能的检测 ➢体内试验
(一) 溶血空斑试验
经典的溶血空斑试验：检测动物抗体形成细胞功能
免疫活性细胞：淋巴细胞 免疫细胞 辅佐作用细胞：单核-巨噬细胞等
参与细胞：N、E、B等
第一节 免疫细胞的分离
➢ 外周血单个核细胞分离 ➢ 淋巴细胞的分离 ➢ T 、B细胞和T细胞亚群的分离
细胞分离基本原理
自然沉降 细胞的特性： 密度梯度离心技术 细胞表面标志：流式细胞仪
免疫磁性微珠分离法
一、外周血单个核细胞分离
一、T细胞功能的检测
➢T细胞增殖试验 ➢T细胞分泌功能测定 ➢T细胞介导的细胞毒试验 ➢体内试验
（一）T淋巴细胞增殖试验
1. 原理：
淋巴细胞
刺激物
DNA合成 母细胞
分化
细胞变大
细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
2. 淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、B细胞