_Sn-2二十二碳六烯酸甘油单酯的酶法合成

由表 ２可见， 硼酸的加入使 Ｓ ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ 的峰面积减小， 比例提高。由于酰基转移反应难以 避免， Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ常与 Ｓ ｎ－ １Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ共 存。在反应体系中加入硼酸后， 虽然酶的活性有所 ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ的比例得到较大提升。 降低， 但是 Ｓ 因此若要制备高纯度的 Ｓ ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ ， 应采用 ５ ０ｍ ｇ ／ ｍ Ｌ的硼酸乙醇溶液。 ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ中 １位 硼酸可以迅速与产物 Ｓ 和 ３位的羟基形成螯合物， 从而有效地阻止产物发
１ 材料与方法
１ ． １ 试验材料 二十 二 碳 六 烯 酸 甘 油 单 酯 对 照 品： 美国 Ｎ ｕ－ ｃ ｈ ｅ ｋ 公司； 固定化脂肪酶（ Ｌ ｉ ｐ ｏ ｚ ｙ ｍ ｅ ４ ３ ５ 、 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｚ ｙ ｍ ｅＴ Ｌ Ｉ Ｍ） ： Ｎ ｏ ｖ ｏ ｚ ｙ ｍ ｅ ｓ 公司； 鱼油、 藻油： 市售。 １ ． ２ 试验仪器 岛津 Ｕ Ｆ Ｌ Ｃ系统： Ｌ Ｃ－ ２ ０ Ａ Ｄ泵， Ｓ Ｉ Ｌ－ ２ ０ Ａ自动 进样器， Ｃ Ｔ Ｏ－２ ０ Ａ 柱温箱， Ｓ Ｐ Ｄ－２ ０ Ａ 检测器， Ｌ ａ ｂ Ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ １ ． ２ ４液相分析软件； Ｚ系列层析柱： 上海沪 西公司。 １ ． ３ 试验方法 １ ． ３ ． １ 酶解原料的筛选 １ ． ３ ． １ ． １ Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ的检测方法的建立 以Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ－ Ｕ Ｖ为检测方法， 色谱条件为色谱柱： Ａ ｇ ｉ ｌ ｅ ｎ ｔ Ｚ Ｏ Ｒ Ｂ Ａ ＸＳ Ｂ－Ｃ １ ８ ； 检测波长： ２ ０ ５ｎ ｍ ； 柱温： ３ ０℃； 流动相： 乙腈 ∶ ０ ． １ ％ 乙酸水溶液 ＝ ７ ０ ∶ ３ ０ ； 进样 量： １ ０μ Ｌ流速： １ｍ Ｌ ／ ｍ ｉ ｎ 。 Ｓ ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ的保留时 在此色谱条件下， 间约为 １ ９ ． ２ｍ ｉ ｎ ， 其同分异构体 Ｓ ｎ－ １Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ
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２ 的保留时间约为 １ ７ ． ５ｍ ｉ ｎ 。 １ ． ３ ． １ ． ２ 原料筛选方法 称鱼油或藻油约 ４ ０ｍ ｇ ， 加入乙醚２ｍ Ｌ 使溶。加
［ ７ ］ ７ ０μ Ｌ乙基溴化镁（ ３ ． ０ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ乙醚溶液） ，wk.baidu.com振 入６
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅＣ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅＣ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ ｓ ａ ｎ ｄＯ ｉ ｌ ｓ Ａ ｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
表２ 硼酸浓度对 Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ峰面积和比例的影响 ｍ ｇ ／ ｍ Ｌ 硼酸质量浓度 ／ ０ ２ ０ ５ ０ 峰面积 ２１ ６ ７５ ９ ４ ８ ５ ３３ ７ ０ ８ ０ ０８ ０ ３ Ｓ ｎ － １ ： Ｓ ｎ － ２ ３ ∶ ７ １ ∶ ９ １ ∶ １ １
， 其中， 效率最高应用最广的是丹麦 Ｎ ｏ
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Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅＣ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅＣ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ ｓ ａ ｎ ｄＯ ｉ ｌ ｓ Ａ ｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 格氏反应后 Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ的含量最高， 是制备 Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ的理想原料。 ２ ． ２ 反应条件的确定和优化 目前富集甘油单酯主要采用 １ ， ３－特异性固定 化脂肪酶
基金项目： 福建省科技厅重点项目（ ２ ０ １ ３ Ｎ ０ ０ １ ４ ） 收稿日期： ２ ０ １ ５－ ０ ６－ ２ ５ 作者简介： 何建林， 男， １ ９ ８ ２年出生， 助理研究员， 海洋药物 通讯作者： 易瑞灶， 男， １ ９ ５ ２年出生， 研究员， 海洋天然产物化学 和海洋药物
［ ３ ］
２ ］ 管的炎症， 是治疗过敏性哮喘的潜在药物 ［ 。Ｓ ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ的活性代谢物可减小肺动脉平滑肌
反应原料， 再利用特异性固定化脂肪酶乙醇解甘油 ｎ － １位和 Ｓ ｎ － ３位的脂肪酸， 最后以柱 三酯原料中 Ｓ 层析法分离纯化得到高纯度的 Ｓ ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ 。 该方法可行性强， 成本低， 易于推广。
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Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅＣ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅＣ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ ｓ ａ ｎ ｄＯ ｉ ｌ ｓ Ａ ｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
Ｓ ｎ － ２二十二碳六烯酸甘油单酯的酶法合成
何建林 白锴凯 洪碧红 陈伟珠 易瑞灶
（ 国家海洋局第三海洋研究所 国家海洋局海洋生物资源综合利用工程技术研究中心， 厦门 ３ ６ １ ０ ０ ５ ） 摘 要 以甘油三酯型鱼油为原料， 利用天然 Ｄ Ｈ Ａ相对富集于甘油酯 ２位的特点， 以１ ， ３－ 特异性固定 ｎ － ２二十二碳六烯酸甘油单酯（ Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ ） 。建立了“ 格氏反应 － 薄层色谱 － 高 化脂肪酶催化制备 Ｓ 效液相色谱” 联用以 Ｓ ｎ － ２位 Ｄ Ｈ Ａ含量为标准筛选最佳反应原料的方法， 随后考察了反应体系， 硼酸浓度， 反 应温度和反应时间等因素以优化反应条件。结果表明， 以优选的甘油三酯型鱼油为原料， ５ ０ｍ ｇ ／ ｍ Ｌ硼酸乙醇 溶液 ∶ 鱼油 ∶ 固定化脂肪酶 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｚ ｙ ｍ ｅ Ｔ ＬＩ Ｍ 质量比等于 ４ ０ ∶ ８ ０ ∶ １ ８构建反应体系， 在常温下反应 ４ｈ ， 反应产物减 压蒸馏后， 经硅胶柱层析纯化， 所得 Ｓ ｎ － ２二十二碳六烯酸甘油单酯的纯度达 ９ ０ ％以上。 关键词 二十二碳六烯酸甘油单酯 乙醇解 固定化脂肪酶 中图分类号： Ｏ ６ ９ 文献标识码： Ａ 网络出版时间： 2016-01-29 14:31:36 网络出版地址： http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2864.TS.20160129.1431.010.html ω－ ３多不饱和脂肪酸甘油单酯在食品和制药行 业中具有许多潜在的应用， 目前对此类化合物的研 究方兴未艾。Ｓ ｎ － ２二十二碳六烯酸甘油单酯（ Ｓ ｎ－ ） 是其中最具代表性的化合物， 其Ｄ Ｈ Ａ ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ 分子结合在甘 油 骨 架 的 ２位， 与母乳中 Ｄ Ｈ Ａ的 存 Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ易被小 在形式相仿。研究表明， 肠黏膜吸收入血， 生物利用度高于二十二碳六烯酸 ［ ］ Ｈ Ａ１ 。Ｓ ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ在过敏性 乙酯和游离 Ｄ 哮喘模型中可以抑制 Ｒ ｈ ｏ 激酶的活化从而减 轻 气
在不同的三酰甘油原料中， Ｄ Ｈ Ａ在甘油骨架上 的分布不同， 分布在 Ｓ ｎ－ ２位的 Ｄ Ｈ Ａ越多，在酶解 反应中经 １ ， ３－特异性脂肪酶去乙酰后得到 Ｓ ｎ－ ２ Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ的可能性越大。乙基溴化镁中的碳负离 得到大 子优先进攻三酰甘油中 １位和 ３位的酰基碳， 量的 Ｓ ｎ － ２甘油单酯。由图 １和表 １可知， 鱼油 Ｃ经
图２ 酶的种类对 Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ峰面积的影响
生酰基转移作用， 在随后的蒸馏和柱层析过程中被 除去。 ２ ． ２ ． ２ 反应温度 ０ｇ ， 加入 ５ ０ｍ ｇ ／ ｍ Ｌ的硼酸乙醇溶液 称鱼油 Ｃ４ ８ ０ｇ ， 混合均匀并放置于不同温度下 （ 见表 ３ ） 。Ｔ Ｌ Ｉ Ｍ酶 １ ８ｇ 分别装入 Ｚ系列层析柱中， 恒流泵以 ３ ０ 的速度将反应物泵入层析柱中进行反应。４ ｍ Ｌ ／ ｍ ｉ ｎ ｈ 后停止反应。反应物悬蒸除去乙醇后， 取１ ０μ Ｌ于 ０ｍ Ｌ ， 涡旋 ３ ０ｓ 后， ０ ． 塑料离心管中。再加入乙腈１ ２ ２μ ｍ滤膜过滤后于 １ ． ２色谱条件下进样， 并记录峰 面积， 试验结果见表 ３ 。
２ 结果与讨论
２ ． １ 酶解原料的筛选 称取鱼油 Ａ４ ８ ． ６ｍ ｇ 、 鱼油 Ｂ４ １ ． ８ｍ ｇ 、 鱼油 Ｃ ４ ５ ． ３ｍ ｇ 和藻油 ４ ３ ． ８ｍ ｇ ， 依１ ． ３ ． １方法筛选， 色谱图 见图 １ 。记录色谱峰面积， 计算 Ｓ ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ 的含量， 结果见表 １ 。
［ ８ ］
３
０ｍ Ｌ ／ ｍ ｉ ｎ的速度将上述反应物泵 柱中， 恒流泵以 ３ 入层析柱中进行反应， ８ｈ后停止反应， 反应物悬蒸 ０μ Ｌ于塑料离心管中， 再加入乙腈 除去乙醇后， 取１ １ ０ｍ Ｌ ， 涡旋 ３ ０ｓ 后， ０ ． ２ ２μ ｍ滤膜过滤后于 １ ． ３ ． １ ． １ 色谱条件下进样， 并记录峰面积， 试验结果见表 ２ 。
公司生产的 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｚ ｙ ｍ ｅ４ ３ ５酶， 但价格昂贵。 ｖ ｏ ｚ ｙ ｍ ｅ ｓ 本课题组对 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｚ ｙ ｍ ｅＴ ＬＩ Ｍ 酶和 ４ ３ ５酶进行了比较 研究， 如图 ２所示， 在本课题构建的反应体系下， 两 者酶解生成 Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ的速度相当， 故选用 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｚ ｙ ｍ ｅＴ ＬＩ Ｍ 酶。
表１ 格氏反应后四种不同原料中 Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ的含量测定 原料 鱼油 Ａ 鱼油 Ｂ 鱼油 Ｃ 藻油 峰面积 ３ ７ ６６ ７ ３ ２４ ８ ７２ ９ ７ １ ６４ ４ ８０ ７ ０ １２ ９ ８２ ７ ９ 质量浓度 ／ ｍ ｇ ／ Ｌ １ ０ ． ４ ７ ６ ８ ． １ ５ ４ ４ ９ ． ６ ６ ３ ５ ． ６ ５ 图１ 格氏反应后不同原料的 Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ图谱
摇１ ５ｓ ， 加入乙酸 ３ ０ ０μ Ｌ ， 然后加入０ ． ４ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 硼酸 ５ ｍ Ｌ中止反应， 乙醚萃取， 再以 ０ ． ４ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ硼酸 ／ ２ ％碳 酸氢钠（ １ ∶ １ ） ５ｍ Ｌ洗涤。 所得样品于薄层硅胶板点样， 再以氯仿 ∶ 丙酮 ∶ 乙 酸（ ９ ６ ∶ ４ ∶ １ ） 展开。于 ２ ５ ４ｎ ｍ 紫外灯下， 刮取 Ｍ Ａ Ｇ 条带， ０ ． ５ｍ Ｌ乙腈溶解， 涡旋 ２ｍ ｉ ｎ 后， 孔径 ０ ． ２ ２μ ｍ 有机滤膜过滤， 于１ ． ３ ． １ ． １项下所述色谱条件进样。 ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ的峰面积以 记录色谱峰面积， 以Ｓ 及比例为标准选取原料。 １ ． ３ ． ２ 反应条件的确立和优化 以Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ的峰面积以及比例为标准 分别对不同的硼酸浓度、 反应温度、 反应时间进行考 察以确立最佳的反应条件。 １ ． ３ ． ３ Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ的分离纯化 填充 ３ ０ ０－ ４ ０ ０目硅胶， 上样 ４ ０ｇ 反应产物， 以 乙酸乙酯 ∶ 石油醚 ＝ ３ ∶ ２混合溶剂为流动相洗脱， 薄 层色谱初步检测流出产物。甘油三酯 ／ 甘油二酯 ／ 乙 游离酸的混合物先流出。 Ｓ ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ最 酯／ 后流出。２ ０ ０ｍ Ｌ三角烧瓶收集， 分别减压蒸馏至溶 剂挥干， 称重， 合并相同含量者。 １ ． ３ ． ４ Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ的纯度测定 取所制 Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－Ｍ Ａ Ｇ样品， 按１ ． ３ ． １ ． １项 下色谱条件， 记录所有色谱峰的出峰时间和峰面积， 按面积归 一 化 法 计 算 出 峰 时 间 约 １ ９ ． １ ２ｍ ｉ ｎ的 峰 （ Ｓ ｎ － ２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ ） 的纯度。
对钙离子的敏感度， 有可能开发成治疗肺动脉高压 加拿大已开展包括 Ｓ ｎ－ ２Ｄ Ｈ Ａ－ 的药物 。目前， Ｍ Ａ Ｇ在内的 ω－ ３多 不 饱 和 脂 肪 酸 甘 油 单 酯 的 药 物研发。 天然多 不 饱 和 脂 肪 酸 多 以 三 酰 甘 油 的 形 式 存 在。在以此为原料开展的甘油单酯富集多不饱和脂 ４ － ６ ］ 肪酸的研究报道中 ［ ， 其终产物为多种多不饱和脂 肪酸甘 油 单 酯 的 混 合 物， 也鲜见以 Ｓ ｎ－２Ｄ Ｈ Ａ－ Ｍ Ａ Ｇ为终产品的制备研究。本研究开发了一套“ 格 氏反应 －薄层色谱 －高效液相色谱” 联用的方法以 甘油三酯 Ｓ ｎ－ ２位上 Ｄ Ｈ Ａ的含量为标准筛选最佳