发酵基因工程菌

67%
4
165.0
68%
5
139.9
64%
*L-天冬酰氨酶
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4、诱导时机对表达的影响
诱导时机指加入诱导剂的时间
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控制基质浓度流加 恒pH流加 恒溶氧流加 控制比生长速率的葡萄糖流加
1
1
1、控制基质浓度流加
用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙 酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极 检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通 过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度 在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由 于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄 糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄 糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制 效应，达到很高的细胞浓度。
2.27 26.4%
5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9%
*鲤鱼生长激素基因工程菌
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1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发 现，当发酵液的溶氧为1.8~2.6ppm/L时， 菌体湿重为1.9~2.08g/L外源基因表达量为 13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到 4.0ppm/L时菌体湿重为2.27g/L外源基因表 达量为26.4%。在诱导表达期间，要维持外 源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量 的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大 通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值， 不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白 产物的形成。
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提高质粒稳定性的方法 1、两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，
第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压 力如抗生素等，以抑制质粒丢 失菌的生长。
2、通过控制环境参数（温度、PH、培养基组分和溶解 氧浓度），调节比 生长速率，使工程菌生长具有优势。有 些含质粒的菌对发酵环境的改变 比不含质粒的菌反应慢， 因而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比 生长速率，可 以改善质粒的稳定性。
优点：
人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解 得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因 操作；
大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高 细胞浓度（50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
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大肠杆菌作为宿主的主要问题是
大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在 细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被 水解或形成不溶的包含体。包含体蛋白是 不折叠的，必须重新溶解并使它复性。
其他: 链霉菌：不致病、使用安全，分泌能力强，
可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基 化能力，可做理想的受体菌。
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3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物 现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等 优点 生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25% 个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发 酵液中回收。不产内毒素 有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。 缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难， 外源蛋白分泌到胞外也有限。
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在大的反应器中含有非常多的细胞，总会 存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每 毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞， 那么在这个反应器中就含有109个无质粒 细胞。 质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如 溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀 释速率。 许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒 附着在一起形成一个单位。
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3、恒溶氧流加
用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱 和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速 率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧， 从而降低溶氧浓度，引起读数下降。当读数 下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随 之减少，溶氧逐渐上升，从而达到供需平衡。 Konstantinov等进一步发展了这种方法，用 DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、 搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓 度，从而获得高密度和高表达
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4、控制比生长速率的葡萄糖流加 菌体的比生长速率与代谢产物的表达 密切相关。比生长速率太大，超过某 一值，易产生乙酸，这一比生长速率 值称为菌体的乙酸产生临界比生长速 率。通过考察得出最优比生长速率， 控制溶氧、转速、补糖来控制比生长 速率。
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五、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果
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四、重组大肠杆菌的培养策略
关键点：高密度、高表达
菌密度的测定：光密度（OD值或A值） 在波长600～660nm 菌生长的障碍是
重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长 缓慢
外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合成后 就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度 疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作 用，甚至会导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌 的比生长速率往往远小于宿主菌。
只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译 后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。
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丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加 工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等 真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全 菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。
影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝 （2）外源基因的表达效率：启动子 （3）外源蛋白的糖基化： （4）宿主菌珠的影响：菌体生长力强；菌体
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3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。 这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标 蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启 动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细 胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子， 通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的 表达。
（2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被 蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。 （3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到 原核蛋白信号肽序列的下游。
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2、G+细菌
枯草杆菌是G+菌，没有外膜，能把蛋白分 泌（excretion）到胞外。不能使蛋白质糖 基化
缺陷:枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快 降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠 杆菌困难，质粒稳定性也比较差
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2、pH值对工程菌生长和表达的影响
在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同 菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有 一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培 养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋 白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白 的表达不利，因此，表达时要调节pH在 6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表 达。
通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量
1 1 150 1.8 7.0 0.7 4
1.9 13.8%
2 2 250 2.6 7.8 0.77 4
2.08 16.7%
3 3 500 3.8 7.5 0.74 6
2.10 18.2%
4 3 500 4.0 7.0 0.83 6
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分离丢失示意图
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2、质粒结构不稳定性
指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺 失所致工程菌性能的改变。如果质粒发生 突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合 成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有 抗生素的培养基中生长。而且由于不合成 外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快， 使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占 统治地位，这种培养情况就是结构不稳定 性。
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4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体 系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如 果变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体 系统有生长优势，那么变异了的系统将最终 占优势，基因不稳定性就出现。
（四）表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要 有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、 氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
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（三）基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但 是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损 害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白 的能力的细胞一般生长得快得多，从而能 替代有生产能力的菌株，这就导致基因的 不稳定性。 基因的不稳定性原因： 分离丢失 结构不稳定性 宿主细胞调节突变
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1、分离丢失
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2、恒pH流加
大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。 这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨， 造成氨积累的原因。因此用葡萄糖代替酸 液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制 系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了 比生长速率降低的时间，细胞密度是无流 加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨 水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡 萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往 不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌 不适宜。
大量的外源蛋白会触发热冲击响应。增 加蛋白水解酶的活性。此时，蛋白水解酶 使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。
翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始， 故目的蛋白质N端常多一个甲硫氨酸残基， 引起免疫反应。
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真核基因在大肠杆菌中的表达方式 （1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋
白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。 优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高 效表达；但只能做抗原。 不做人体注射用药。
内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。
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4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排 列，而且所有转译后处理（修饰）与在整 个动物中相同，在某种情况下可能转译后 修饰有些不同，但它可提供最接近于天然 副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞 外。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵， 蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋 白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢 细胞）。
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三类主要基因工程表达体系的比较
表达体系 产物 产生部位 培养方式 产物活性 浅在危险
大肠杆菌 多肽、蛋白 菌内 融合蛋白
部分可高产
对原核好 不大
酵 母 多肽、蛋白 菌内 可高产 真核接近 不大 糖基化蛋白 胞外 天然
动物细胞 完整 胞外
几乎可为 可能有
糖基化蛋白
可高产 天然产物 致癌因素
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三、利用基因工程菌生产的特点
指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代 菌的现象。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷 贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代 细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质 粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可 能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。 虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百 万细胞分裂中一个）。
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3、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加， 但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒 性，合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响
诱导时间 酶活力 酶表达水平
0
0.02
1
52.3
37%
2
118.8
57%
3
120.8
发酵基因工程菌
细胞因子、疫苗、酶
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二、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统 要求：翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全， 列入FDA表中 常用的宿主系统有：大肠杆菌
G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
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1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠 杆菌作为宿主。
（一）基因工程菌带有外源基因，外源基 因可能在质粒上也可能整合到染色体上， 这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌 往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样 就会大大降低产物的表达。为了抑制基因 丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择 压力，如抗生素。
（二）基因工程菌的培养一般分两段。前 期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱 导因子，诱发产物表达。
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高表达的障碍是： 外源基因的不稳定，造成表达的下降 高生长速率与高表达之间的矛盾 乙酸的产生 蛋白的降解
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高密度培养的措施
分批补料培养 以分批培养为基础，吸取 了连续培养的优点，可消除高浓度底物对 细胞生长的抑制作用，还可以弥补低浓度 底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控 制了菌体的生长过程。因此，要实现重组 大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效 的方法就是分批流加补料培养法。现在常 用的是反馈补料培养。有几种反馈控制