SCGE法检测DNA损伤(包括DNA单链断裂和DNA交联)

SCGE法检测DNA损伤
SCGE的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性）
SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。

该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。

如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。

若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。

只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。

如果在碱性电泳液(pH>13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。

细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。

因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。

1. 仪器及试剂
冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。

不含Ca2+、Mg2+的PBS (PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（NMA）及低溶点琼脂糖（LMA）（0.6％溶于PBS）；细胞裂解液（2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1%肌氨酸钠, PH=10, 用前加1％TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO））；电泳缓冲液（0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, PH=13）；0.4 M Tris-HCl（PH=7.5）；无水乙醇；20-30μg/mL 溴化乙锭（EB）。

2. 方法
1.在体外实验中,将对数期生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞备用。

在体内实验中,取需测试的脏器或组织,用磷酸缓冲液( PBS,PH 7.4) 洗净后,剪至糜状滴加PBS(PH 7.4) 研磨,过300 目筛子,收集细胞,悬浮于PBS(PH 7.4) 中, 细胞密度为（1-5） x 104-6个/ mL （血细胞计数板最中央每小格0.5个细胞）,台盼蓝染色、镜检、细胞存活率90 %以上,即可进行以下操作。

2.样品处理：
1）通过尾动脉取血，肝素或枸椽酸钠抗凝，800r/min离心5min，加等体积无钙镁磷酸缓冲液，获得细胞悬液。

a.枸椽酸钠抗凝:有2Na
3C
6
H
5
O
7。

和2Na
3
C
6
H
5
·11H2O等多种晶体。

通常用前者配成
109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l浓度），与血液按1：9或1：4比例使用。

枸椽钠对凝血V因子有较好的保护作用。

b.肝素（heparin）每毫升血液抗凝需要持素15±2.5Iu.
c.EDTA盐经1000C烘干，抗凝作用不变，通常配成15g/L水溶液，每瓶0.4ml，干燥后可抗凝5ml血液。

EDTA盐对红、白细胞形态影响很小.
2）过氧化氢处理：细胞悬液分成两份:A份1ml； B份0.9ml。

B份里再加0.1ml 5mmol的过氧化氢，混匀。

全部冰浴1小时。

完后检测细胞存活率(台盼蓝染色、镜检)(过氧化氢处理用于检测DNA交联)。

3）应用细胞悬液制备：4度下，1000r/min离心5分钟。

去上清，加PBS(PH 7.4)。

每份制作2片凝胶。

3. 制胶
将载玻片用砂纸(粒度No. 380)磨出痕迹, 以便凝胶附着. 将37C正常溶点0.6％琼脂糖液（溶于不含Ca2+、Mg2+的PBS，需要沸水加热）75-100μl铺展到预热的磨痕载玻片上，作为第一层凝胶，盖上盖玻片4℃凝固10分钟以上, 去掉盖玻片后加入制备的细胞悬液85μl(10μl含1000 个细胞的PBS和75μl 0.6%的低熔点琼脂糖(LMA) 在37℃混匀)铺展到载玻片上作为第二层, 4℃至少10分钟, 凝固后再铺展低溶点0.6％琼脂糖100μl作为第三层, 使载玻片上琼脂糖呈“三夹层”式.
（注意：NMA 适宜浓度0. 5 %～1 % ,过高或过低将造成凝固速度过快而不易铺平或粘着力低而脱落,铺胶前载玻片预热,有利于铺植平整。

LMA 凝胶浓度直接关系到DNA 迁移长度 ,0. 6 % 较适宜。

第3 层LMA 可不铺。

微量加样器吸头前端残留凝胶勿吹出,以防形成气泡。

移去盖玻片时注意勿损伤胶膜）
4. 裂解
4℃凝固后去掉盖玻片，将载玻片浸人新配制的4℃预冷细胞裂解液（含2.5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM Tris-HCl(PH=10)，用前加1％ TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO）），裂解不少于1h。

此步骤的目的即是溶解细胞膜及核膜,除去蛋白质、RNA 等,仅存留核骨架。

5. 电泳
裂解后将玻片晾干，并列置于水平电泳槽的阳极端，电泳缓冲液(0.3M NaOH、1mM EDTA)盖过胶面约2.5mm，静置20-60min解链。

之后接通电源，电泳条件25V，300mA，时间20-40分钟。

通过调节液面来调电压。

(电压先调到最大，电流300mA 然后通过液面来调节电压)。

（注意：电泳时电压、电流及时间的长短会直接影响DNA 迁移长度,造成假阳性或假阴性。

文献报道为18～50 V ,200～300 mA ,20～40 min。

我们采用25 V ,300 mA ,20min ,效果良好。

电泳进行中应持续监测,吸出或加入电泳液,调节液面高度,保持电压与电流的恒定）
6，染色
电泳结束后，用0.4 M Tris-HCl (PH＝7.5) 洗涤三次，每次5分钟，呈中性后，凉干玻片，(无水乙醇处理30分钟可增加荧光强度) 每片滴加50μl 20-30μg ／ml的EB染色15～20min，然后用蒸馏水洗滴，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察。

24小时内检测，时间过长将导致荧光褪色。

（注意：可在染色后4 ℃避光潮湿条件下保存,数日后观察。

但我们通过实践得出为防止荧光衰减,尽快阅片较好。

阅片过程中,由于淬灭效应,荧光减弱很快,
因此操作必须紧凑。

结果可直接在荧光显微镜下分析,或先摄影,再进行照片分
析。

但摄影、相片冲洗条件等较难控制统一,因此应尽量直接分析）
以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。

应尽快阅片，时间过长将导致荧光褪色。

6．观察
使用100W汞灯作为荧光光源，在荧光显微镜（激发波长为549nm,发射波长为590nm）下，损伤的细胞DNA呈现由圆形、致密红色核心（慧头）和朝向阳极的尾端DNA碎片（慧尾）构成的“慧星”。

本实验选用DNA断裂分级和DNA慧星尾长两种观察指标。

DNA断裂分级按慧星尾部占全部DNA量的比例判断。

0级：无断裂级损伤；A级：轻度断裂损伤，断裂损伤〈10%；B级：中度断裂损伤，断裂损伤10%-20%；C级：重度断裂损伤，断裂损伤<60%；D级：重度断裂损伤，断裂损伤>60% “慧星”,每片随机计数50个“慧星”，计算各级所占比例。

DNA慧星尾长是在高倍镜下直接测量出“慧头”中心到“慧尾”的长度(格数)。

每片随机测量25个“慧星”尾长,计算均数。

7．统计分析：应用SPSS软件分别对彗星尾长和断裂进行方差分析和卡平方检验。

表一：
编号
DNA断裂损伤分级
0 A B C D
表二：
编号尾长头直径下降率
预期结果：污染越严重，随着DNA链受损程度越大, 出现慧尾的细胞数越多，慧星尾中的DNA含量及尾长也就增加。

单细胞凝胶电泳技术在军事毒理学中的应用
作者：张慧丽余卫闫长会2003-9-2
由Ostling和Jonhanson首先提出，后又经Singh和Olive建立和改进的单细胞凝胶电泳(Single Cell Gel Electrophoresis，简称SCGE)技术，因其细胞电泳形状颇似慧星，又称慧星试验(Comet Assay)。

它是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记，具有极高的实用价值。

该技术可用于体内、体外各种实验，目前已广泛地应用于各种有核细胞经受试物诱导的DNA损伤和修复的研究。

在国外，SCGE 被用于遗传毒理学、放射生物学、环境生物监测、药物筛选、肿瘤发病机理及诊断与治疗、衰老和细胞凋亡机制的研究等，正在形成一个新的研究领域，有关应用该技术的报告也是逐年增加［1，2］。

然而，国内关于该技术的研究报告仅有几篇。

本文就该技术的原理、操作程序和方法作一简介，并预测其在军事毒理学研究中将有广阔的应用前景。

1 SCGE的原理
SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。

该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。

如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。

若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。

只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。

如果在碱性电泳液(pH>13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。

细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。

因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。

2 SCGE实验程序和方法
至今，SCGE技术在世界上许多实验室应用，操作上进行了许多改良，并不断地融进新技术，如荧光原位杂交彗星试验［3］等。

但是，最常用的还是碱性SCGE 方法，其基本操作程序如下：
2.1 处理因素如今已有70多种处理因素，简要概括为：辐射因素(X射线，60Co、137Cs、125I等发出的γ射线，各种紫外线，中子等)、各处氧化剂(H2O2、KMnO4、NaAsO4等)、烃化剂(顺泊、丝裂霉素、氮芥、AzQ、BzQ等)、抗癌药(Bleomycin、环磷酰胺等)、诱变剂(MNNG、MCC等)、农药(二氯胺基酚等)、溶剂(苯、甲苯、二甲苯等)、重金属、环境因素(烟雾、CO、高温、低温、粉尘等)、药物(吗啡、咖啡因等)。

处理方式(体内或体外)及处理时间根据实验研究目的而定。

2.2 制备细胞悬液单细胞来自人、动物(小鼠、大鼠、中国仓鼠、狗、鱼、鸡等)和植物的组织或培养的细胞系。

Mckelvey-Martin 和Fairbairn等人曾报道从活体组织分离的原代细胞近20种，近两年又有脱落的人颊粘膜细胞、人白血病K562细胞、鱼的红细胞、植物种子细胞等，其中最常用的是人外周血淋巴细胞。

经过培养的正常组织细胞或肿瘤组织细胞已有20余种，如Hela细胞、MeWo细胞、BEAs细胞NHBE细胞等。

根据不同组织细胞生长培养条件，选择合适的培养基和缓冲液，分离纯化制成单细胞悬液，用台盼蓝法测定细胞存活率>95%，细胞密度为(1～5）×10（4～6）／ml备用。

2.3 制片选用的载玻片宜薄不宜厚，单面加水磨沙应均匀细密。

铺胶分作3层：第1层，在磨沙面上滴加正常熔点琼脂糖(溶于不含Ca2+、Mg2+的PBS中)，其目的是加强凝胶对玻片的附着。

第2层为含细胞(104-6)的低溶点琼脂糖(37℃)。

第3层是不含细胞的低溶点琼脂糖。

2.4 细胞裂解(碱性SCGE) 移去胶板上的盖玻片，将胶板浸入新配制的预冷4℃裂解液(2.5M NaCl、100mN Na2EDTA、10mN Tris-HCl pH 10、1%肌氨酸钠、用前加1%Triton和1%DMSO)中至少1h。

2.5 DNA展开、电泳裂解后载玻片置于水平电脉槽内，使新配制的碱性电泳液(1mM Na2EDTA、300mM NaOH)盖过胶面约0.25cm,电泳槽置于4℃静止20～40min,使DNA充分展开。

电泳条件25V，300mA,时间10～40min。

2.6 中和、染色电泳后取出载玻片，用缓冲液(0.4M Tris-HCl,pH7.5)将胶板浸没15min或滴洗3次，每次5min。

近来有报道中和后再用无水乙醇或甲醇处理，可明显增强DNA的荧光强度［4］。

每张胶板上滴加20～100μl染色剂(吖啶橙、溴化乙锭、碘化丙啶、4，6-联脒-2-苯基吲哚亦称DAPI、苯并ts18
3.gif (156 bytes)唑-4-喹啉又称YOYO-1、Anti-Brdu antybody、Hoechst 33342和33258)，染色2～20min，然后用蒸馏水洗滴。

应尽快阅片，时间过长将导致荧光褪色。

以上各步骤应在黄或红光下操作。

2.7 图像分析在荧光显微镜下，观察单细胞电泳图象(放大200×或400×)，每片记数25～50个细胞，每组2～3张玻片。

观察方法有：目镜测微尺直接测量、显微照像后用两脚规测量、图象分析仪进行分析。

DNA损伤的测量参数有尾长(tail lenth)是损伤DNA迁移的长度，在低损伤剂量范围内与损伤呈线性关系；尾部DNA密度，与损伤程度有关；尾矩(tail moment)是尾长与尾部DNA百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾块(tail local)是彗星尾部分散的大小不一的DNA断片组成，与损伤程度有关；尾惯量(tailinertia)是与每个尾块的面积、平均荧光强度、在X轴上与彗核中心距离有关的综合性指标。

国内主要采用目镜测微尺观测，计算DNA迁移的细胞率和DNA迁移长度。

单细胞凝胶电泳技术影响因素的分析
马爱国臧金林刘四朝
单细胞凝胶电泳(SCGE)又称“彗星”法，是一种操作简便、快速、敏感性高的DNA 损伤与修复的检测技术［1］。

尽管此法无需复杂的实验条件，但在建立过程中可能受诸多因素的影响而难以得到较理想的结果，我们就其主要的影响因素作如下分析。

1．琼脂糖凝胶薄板的制备：该实验需要制备两层琼脂糖凝胶薄板，应注意琼脂糖的浓度、制备时间和温度。

第1层是紧贴冰冻玻片砂面的1%正常凝点(42±2)℃的琼脂糖凝胶，吸取85 μl制成面积为18 mm×18 mm，厚度为0.25 mm 的凝胶。

然后置4℃存放约20分钟，如时间过短，不能得到“老化”的凝胶与玻片粘合不紧,容易在液体浸泡处理和电泳过程中自然脱落，造成实验失败；反之，如果放置时间过长，凝胶极易干裂而脱落。

第2层凝胶是1%低凝点(26±2)℃琼脂糖液，与细胞混合时琼脂糖液的温度30～37℃，温度过高可引起细胞损伤，此操作过程力求快速，以免加速细胞DNA 的修复。

2．细胞数和实验温度的影响：
（1）实验细胞数应调至约3.0×105，如果细胞数过低，一张片子中细胞数太少，很难完成100个彗星计数分析；反之细胞数过高，片中细胞过密，位于不
同层面的细胞相互重叠，难以分析彗星DNA损伤。

(2)实验温度的控制。

样品应置4℃环境下进行，以抑制或降低核酸内切酶等活性，阻止DNA损伤的修复，从而达到准确地检测DNA初级损伤。

已有研究表明一些细胞DNA断裂损伤能在1小时内达到90%的修复，3小时达到97%［2］，因此，应严格控制细胞在分析过程中的温度。

3.碱化处理及电泳的条件:凝胶内的细胞需在碱性(pH值10)环境下进行处理，其作用一是去除细胞蛋白质，使DNA暴露出来；其次是碱化处理使DNA紧密螺旋结构解旋，DNA损伤片断及其极性端暴露出来［3］。

电泳条件：电压或电流过大，严重受损伤的细胞可能出现的拖尾过长，彗星消失而影响结果，其次是正常的细胞可能因电压或电流过大而形成少许拖尾的假阳性结果。

反之，电压或电流过小，受损伤的细胞不会出现拖尾，而出现假阴性结果。

电泳的电压多选用低电压，一般在18～50 V，在电泳过程中电泳液的温度应不超过15℃(应在4℃条件下进行)，电泳时间多在20～40分钟。

4.荧光染色及彗星图象分析：
(1) 采用DAPI荧光剂染色，质量浓度在1～5 μg/ml，用量为10 μl。

染色15分钟后即可观察，视野中明亮荧光的“彗星”被光照时间一般不易超过2分钟，以免荧光剂快速衰退而不宜继续观察和拍照。

(2) 彗星的图像分析主要靠肉眼显微镜读片，对DNA 损伤程度标准的正确判断是非常重要的。

不同程度损伤可根据彗星的尾部与其头部的比率大小分为0、1、2、3、4五个等级。

0级无拖尾表明无损伤，当DNA损伤程度由轻到重，则彗星的尾部逐渐变长变大，头部逐渐变小荧光强度逐渐变弱。

用肉眼观察判断的分级需要通过计算机彗星图象分析加以确定，目前已有彗星电脑分析软件可供使用，如Komet 3.0等［4］。

总之，严格控制SCGE的各种影响因素，使其真正成为一种可靠、易于掌握和有效的DNA断裂损伤和修复检测的新技术［5］。

作者单位：马爱国臧金林(266021 青岛大学医学院医学营养学系)
刘四朝(中国农业科学院研究生院)
参考文献
1 马爱国, 韩秀霞, 刘四朝,等. 两种DNA断裂损伤检测方法敏感性比较. 遗传, 1997， 19: 32-34.
2 马爱国, Collins AR, Duthie SJ, 等. 不同细胞DNA 氧化损伤及自身修复能力的分析. 癌变畸变突变，1997， 9: 138-142.
3 Duthie SJ, Collins AR, Duthie GG, et al. Quercetin and myricetin protect against hydrogen peroxide-induced DNA damage (strand breaks and oxidised pyrimidines) in human lymphocytes. Mutat Res, 1997，393: 223-231.
4 Collins AR, Dobson VL, Dusinska M, et al. The comet assay: what can it really tell us ? Mutat Res， 1997,375:183-193.
5 Collins AR, Dusinska M, Franklin M, et al. Comet Assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen, 1997, 30: 139-146.
单细胞凝胶电泳法检测单细胞DNA损伤
摘要
单细胞凝胶电泳技术已广泛应用于单细胞DNA 损伤的检测。

其实验原理在于损伤的 DNA 在电场中从核内溢出，形成与细胞核“关部”相区别的“尾部”。

目前主要用开头指标、距离指标强度指标、“矩”类指标等四类指标分析实验结果。

单细胞凝胶电泳（single-cell gel eiectrophoresis,SCGE）又称慧星试验（comet assay）是一项较新的电泳方法。

自1978年被Rydcbert B。

等人成功地用于检验DNA单链断裂以来，经过不断的改进，已成为一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法，广泛地应用于DNA放射损伤、DNA剪切损伤、DNA交联的检测、药物的遗传毒性评价、细胞凋亡鉴定等工作中[1]。

1 SCGE 的检测原理
尽管 SCGE 技术己应用近 20 年，但其检测单个细胞 DNA 损伤的确切原理还不甚清楚。

初步认为，各种因素诱发细胞 DNA 损伤后会影响 DNA 的高级结构，使其超螺旅松散。

这种细胞经过实验中细胞原位裂解、 DNA 解链等过程后，电泳时，损伤的 DNA 从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的 DNA 部分保持球形，二者共同形成“慧星”。

在一定范围内，“慧星”的长度（代表DNA 迁移距离）和经荧光染色后“慧星”荧光强度（代表 DNA 的量）与 DNA 损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中的 DNA 损伤 [2,3] 。

2 SCGE 的操作方法
singh 等人 [4] 于 1988 年描述的 SCGE 具体操作方法，被认为是经典的操作方法。

其主要步骤有：将混有待测细胞的琼脂糖铺于载玻片上，凝固后浸入冷溶解液中使细胞裂解，在电泳液中解链后水平电泳，洗涤后用 DNA 结合荧光染料染色，在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像，评价 DNA 的损伤程度。

改变相关的实验条件，可以检测 DNA 不同类型的损伤，这是 SCGE 的优势之一 [5] 。

如果在碱性溶液中溶解、解链、电泳，可以检测 DNA 单链断裂及碱不稳定损伤 [6] ；如果在冷溶解液中加入高浓度盐及其它变性剂，中性条件下溶解、解链、电泳，则可检测 DNA 双链断裂 [7] 。

3 SCGE 的主要计算指标
实验结束后，用荧光显微镜将“慧星”图像放大后拍摄下来进行分析。

典型的 DNA 损伤细胞荧光图像象慧星一样头尾分明。

为了根据图像评价 DNA 的损伤程度，人们设计了一系列的计算指标。

按其性质，大致可分为以下几类：
3.1 形状指标这是一类比较粗略的指标。

根据细胞荧光图像是否象慧星一样头尾分明将其分为慧星一样细胞和非慧星样细胞，计数一定量细胞中慧星样细胞所占的比例，即慧星样细胞发生率，估计 DNA 的损伤程度 [8] 。

这种指标可通过镜下观察直接得到，方便实用。

3.2 距离指标直接在显微镜下或在照片上测出慧星的一些长度数值，如尾长[9,10]，即沿电泳方向“慧星”尾部最远端与头部中心间接的距离；总慧星长度[11]，即“慧星” 电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值[12]等，以评价DNA损伤程度。

这些指标描述电泳中DNA泳动的距离，易于测量，无需复杂的仪器设备及图像处理软件，而且在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用剂量之间有较为良好的线性关系。

3.3 强度指标 Ostling等人 [13] 最初用 SCGE 技术检测射线对 DNA 损
伤时用“慧星”头部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值
来描述 DNA 的损伤。

PoI1er 等人 [14] 用“慧星”尾部总荧光强度同“慧星”头部总荧光强度的比值来表示 DNA 的损伤程度。

新近有报道根据“慧星”尾部荧光强度将细胞分为五类，由弱到强分别计为 0 、 1 、 2 、 3 、 4 ，将 100 个细胞的分值加在一起表示 DNA 的损伤程度，并证明该数值与总慧星长度有较好的相关性 [15] 。

这些指标都不同程度地反映了电泳中泳动 DNA 的量。

3.4 “矩”类指标为反映 DNA 损伤，上述距离类指标和强度类指标均不全面，有实验证明损伤因素作用剂量增大时， DNA 损伤程度明显增加而尾长基本不变 [16] 。

为将二者结合起来，更全面反映 DNA 损伤程度， Olive 等人 [17] 于 1990 年首次描述了“尾矩”（ tail moment ， TM ）的概念，定义为尾部 DNA 占总 DNA 的百分比与头、尾部中心间距的乘积。

作者用实验证实该指标比上述其它指标都优越，很快就被广泛接受。

定义 TM 时将“慧星”尾部当作一个整体考虑，将头、尾部中心间距当作损伤 DNA 的平均迁移距离。

事实上尾部 DNA 由不同 DNA 片段组成，不同片段迁移距离不同，即尾部 DNA 的分布并不均匀。

于是， Kent 等人 [16] 提出“慧星矩”（ comet moment ， CM ）的概念。

以“慧星”头部中心点为零点，沿电泳方向将“慧星”按一定的间隔分成若干个区域（ 80 个即可），分别测定每个区域的荧光强度（ Di ，代表该区域 DNA 量）、该区域中心距零点的距离（ Xi ）、“慧星”总荧光强皮（ Dt ．代表总 DNA 量），则 CM 定义为∑ Di · Xi ／ Dt 。

实验表明 [16] ，损伤因素作用剂量较大时， CM 与作用剂量间的相关性比 TM 更为密切。

近年来该指标也有所应用 [7] 。

与此类似，如果预先设置一定的阈值将“慧星”头尾分开，将尾部分成若干区域，以各区域面积 Si 和平均荧光强度 Di 的乘积表示该区域 DNA 的量，以头尾部总面积（ Sn 、 St ）与头、尾部总荧光强度（ Dh 、 Di ）的乘积表示头、尾部的 DNA 量， CM 就可变化为“尾部惰性”（ tail interia ， TI ），表示为∑ Si · Di · Xi2/ （Sh · Dh ＋ si · Di ）（ xi 为区域中心到头部中心的距离） [18] 。

作者通过比较认为在描述环磷酰胺处理后人外周血淋巴细胞 DNA 损伤时，各种指标中 TI 值的灵敏度是最高的。

TI 值必须借助精密仪器和复杂的软件才可得出，日前应用很少。

4 SCGE 的应用前景
检测外界因素对 DNA 的损伤， SCGE 的检测结果同其它检测方法如程序外DNA 合成（ UDS ）等结果相关较好 [2] ，而且 SCCE 能反映细胞群体中不同类型细胞对作用因素的不同反应，而不仅仅是群体细胞的平均效应水平，为确定遗传毒性因素的靶细胞提供了可能，也可用于肿瘤放、化疗抗性细胞的检出，为疗效评估和预后监测提供依据，同时该法方便易行，无需要求细胞处于生长状态，也无需同位素标记，其应用潜力是巨大的 [12] 。

但由于其理论基础不够明确，各实验室的操作方法差异极大，包括溶解液、电泳波的配方，溶解时间、电泳参数、 DNA 结合荧光染料的选择都远远没有标准化。

评价各实验室结果也没有统一的标准，因此 SCGE 有待于进一步的改进和完善。