基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖固定葡萄糖氧化酶的生物传感器

基于静电吸附碳纳米管和壳聚糖固定

葡萄糖氧化酶的生物传感器

陈文静 屈建莹*

(河南大学化学化工学院,开封475004)

摘 要 以N afi on -聚中性红修饰电极为基底,自组装多壁碳纳米管和壳聚糖之后,再固定上葡萄糖氧化酶,

制成葡萄糖生物传感器。实验表明,本传感器在30e 的PBS(p H 7.0)中对葡萄糖的线性响应范围为5.0@

10-6~2.0@10-3m o l/L,线性相关系数为0.9948,检出限为1.0@10-6mo l/L ,达到95%稳态电流所用的时间

<10s 。本修饰电极具有良好的稳定性,于4e 环境保存30d 后峰电流值约为原来的84.3%,且具有较低的

工作电位,能有效地消除抗坏血酸等的干扰。

关键词 聚中性红,多壁碳纳米管,壳聚糖,葡萄糖氧化酶,生物传感器

2008-10-15收稿;2009-01-02接受

*E-m ai:l qu j y @h enu .edu .c n

1 引 言

近年来,基于静电吸附作用的生物分子固定化方法已逐渐用于各种生物传感器的制备[1~4]。以聚

电解质阴、阳离子的静电吸附作用以及与生物分子通过多层交替自组装所制作的各种生物敏化膜[5~7],

比传统的共价交联与包埋等固定化方法所构成的生物膜具有保持生物分子活性好、性能稳定和制作简便等优点。多壁碳纳米管(MWNTs)具有良好的生物相容性、独特的电学性能、明显的量子效应、大的比表面积、高稳定性以及强吸附特性。壳聚糖(C s)具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性,其丰富的氨基可被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备。中性红(NR )作为一种吩嗪类染料,能在弱酸性溶液中于玻碳(GC)电极表面电氧化聚合成膜,该膜具有附着力好、紧密均匀、制备方法简单等特

点,对生物分子有较强的电催化作用,且工作电位低,可以消除一些电活性物质的干扰。利用MWNTs

[8]和Cs [9,10]固定葡萄糖氧化酶(GOD)制备葡萄糖传感器的研究已有报道,但多采用C s 包埋的方法固定酶,而利用MWNTs 和Cs 的静电吸附作用固定酶的方法还很少有报道。

本实验利用MW CNTs 的比表面积大和C s 生物兼容性好的特点,并利用聚中性红(P NR )与MWNT s 、MWNTs 与Cs 的静电相互作用将其固定在PNR /N afion /GC 电极表面进而吸附GOD,研制成一种新型葡萄糖生物传感器。与已报道的MWNTs 或Cs 修饰的葡萄糖氧化酶传感器相比,本传感器具有灵敏度高、线性范围宽、检出限低、稳定性好等特点。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

C H I650电化学工作站(美国C H I 公司);三电极系统:GC 电极(d =3mm )或化学修饰GC 电极为工作电极,Ag /AgC l(饱和KC l)电极为参比电极,铂丝电极为对电极;p H S-29A 型数字酸度计(上海大中分析仪器厂)。

MWNTs [11],使用前经过浓HNO 3回流处理,长度在微米级,直径10~50nm (德国马尔堡大学化学系材料科学中心);壳聚糖(C s ,脱乙酰度>92%,上海华硕精细化学品有限公司);Nafi o n(5%的乙醇溶液,Fluka 公司);中性红(NR,上海试剂厂);葡萄糖氧化酶(GOD,298U /m g ,S ig m a 公司);KH 2PO 4-K 2H PO 4缓冲溶液(PBS);葡萄糖溶液(使用前放置过夜),50%葡萄糖注射液(漯河市方汇药业有限公司)。其它试剂均为分析纯,实验用水均为二次蒸馏水。

第37卷

2009年5月 分析化学(FENX I HUAXU E) 研究简报Ch i nese Journa l o f A na l y tica l Che m i stry 第5期733~736

2.2 葡萄糖氧化酶电极的制备

将GC 电极依次用1.0、0.3和0.05L m 的A l 2O 3粉在抛光布上抛光至镜面之后,分别用无水乙醇、HNO 3(1B 1,V /V )和水各超声清洗3m i n 。吸取3.0L L 0.1%N afion -乙醇溶液滴加于GC 电极表面,自然晾干,制成Nafion /GC 修饰电极。其中Na fi o n 膜既可以增强NR 在电极上的聚合又可阻挡一些阴离子干扰物。然后在0.025m o l/L PBS(p H 5.5)+0.5m ol/L N a NO 3+0.1mm o l/L NR 溶液中于-1.0~

1.4V 电位下引发数圈,再于-0.8~0.8V 电位下聚合,制成PNR /N afi o n /GC 修饰电极,其膜的厚度可由聚合过程中的扫描圈数来控制。由循环伏安图(图1)可知,聚合时NR 有两对氧化还原峰,峰电流均随扫描圈数增加而增大,说明PNR 膜有良好的导电性。

3.0m g MWNTs 于10mL 无水乙醇中,超声分散得到0.3g /L 黑色悬浮液,经过处理的MWNT s 带有COOH ,荷负电。将上述带正电的PNR 修饰电极浸入MWNTs 悬浮液30m in ,

通过静电吸附得到 图1 中性红电聚合的循环伏安图

F i g.1 CV Curves fo r poly m er izati on of neu tra l red v =50mV /s .

MWNT /PNR /Na fi o n /GC 修饰电极。再将上述电极浸入

1.0%Cs 溶液中,静电吸附30m i n ,得到Cs /M WNT /

PNR /N afi o n /GC 修饰电极。将所得修饰电极浸入5.0

g /L GOD 溶液(p H 7.0的PBS)中,于4e 条件下静电

吸附30m i n 得到GOD /Cs /M WNT /PNR /Nafi o n /GC 修饰

电极,即制得GOD 生物传感器。

2.3 测试方法

采用三电极系统,以GC 或修饰GC 电极为工作电

极,铂丝电极为对电极,Ag /AgC l(饱和KC l)电极为参比电极,扫描速率为100mV /s ,在0.1m ol/L PBS 底液(pH

7.0)和2.0@10-3m o l/L 葡萄糖溶液中进行CV 测定。3 结果与讨论

3.1 修饰电极的电化学行为

图2中a 、b 、c 分别为空白GC 、GOD /PNR /Nafi o n /GC 、GOD /C s/M WNT /PNR /Nafi o n /GC 电极在葡萄糖溶液中的CV 图。在其它条件相同的情况下,3支电极在葡萄糖溶液中的C V 曲线明显不同。曲线c 的氧化还原峰电流比没有吸附MWNTs 和Cs 时大,这说明MWNTs 和Cs 的加入提高了酶电极的催化活性。

图3为葡萄糖传感器对葡萄糖的催化行为曲线。其中图3a 为没有葡萄糖的PBS 溶液(p H 7.0

), 图2 GC 电极(a)、GOD /PNR /N a fi on /GC 修饰电极(b)

和GOD /C s/MW NT /PNR /N afi on /GC 修饰电极(c)的循

环伏安图

F i g .2 CV curv es o f g lassy carbon(GC)(a),g lucose ox-i

dase(GOD )/po ly(neutra l red)(PNR )/N afion /G C(b)and

GOD /Cs /MW NT /PNR /N a fion /GC(c)e l ectrodes

葡萄糖(gl u cose)2.0mm ol/L ,0.1mo l/L PBS (p H 7.0);扫速

(scann i ng rate):100mV /s

。 图3 GOD 修饰电极在加入葡萄糖前后的循环伏安图F i g .3 CV cu rves o f biosensor i n the absence and presence of g lucose a :0.1m ol/L PBS (pH 7.0),w ithout gl u cose ;b :葡萄糖(gl u cose)2.0mm ol/L ,0.1mo l/L PBS (pH 7.0)。扫速(scan -

n i ng rate):100mV /s 。734 分析化学第37卷