犬猫弓形虫病的诊断及防控

b 动物接种法 动物接种法即将病料研磨后过滤加PBS或液体 病料离心浓缩，取上清腹腔接种幼龄小鼠，观察 发病情况。如未获成功，则可采取小鼠的肝、脾、 淋巴结及脑等组织制成组织悬液再腹腔接种健康 小鼠，如此盲传2-3代，可提高检出率，之后没有 发现弓形虫虫体才可以认为阴性。
病原学诊断方法简单，结果可靠，但该方法检出 率低，耗时长，而且有动物接种法有扩散病原的 危险。亦由其特异性和敏感性的原因，常常导致 诊断的错误。新的弓形虫病诊断方法主要在于提 高敏感性和特异性，以及使操作更为简便、快速。
a 多重PCR 多重PCR是为了同时检测几种病原体而在一个 反应体系中加入多对引物以扩增不同的DNA片段， 操作快速简便。在多重测定中，密切相关的病原 体株是由于扩增不同的序列而分开的，所有模板 共有序列的引物可为扩增提供阳性对照。
b 定量竞争性PCR 定量PCR是设计与目的基因有相同引物结合部 位(同源性竞争模板)或有不同引物结合部位(异源 性竞争模板)的内参照，通过扩增后内参照的DNA 产物含量来推算标本中目的DNA或mRNA的含量，是 一种定量准确的PCR方法。 c 原位PCR 原位PCR是将原位杂交的定位性与PCR的高敏 感性结合起来的技术，能在组织切片或细胞涂片 上原位对特定 DNA或RNA进行扩增，省略了提取 DNA的繁琐步骤，对于样本量少或不能获得较大样 本组织的检测提供了一个可行方法。
• 免疫学诊断 a 间接血凝实验（IHA） 其原理是建立在抗原与抗体特异性结合基础上的。 本法具有操作简便、微量、快速、特异、廉价等 特点，适合辅助诊断和大规模流行病学调查，也 是国内各实验室最常用方法之一。但IHA存在着敏 感性不很高，一般不能反应现症感染的缺点。
b 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA可检测抗弓形虫的IgM、IgA、IgG、IgE抗 体及C抗原(循环抗原)。 ELISA用于诊断弓形虫病作了较多研究，衍生出 多种方法，如间接ELISA、PPA-ELISA(金萄菌A蛋 白-酶联免疫吸附试验)、ABC-ELISA(生物素-亲和 素过氧化物酶联免疫吸附试验)、BA-ELISA(亲和 素生物素ELISA)、Dot-ELISA (斑点酶联免疫吸附试验)、双夹心ELISA等。
目前研究表明ELISA具有敏感性高、特异性强、 检测速度较以往的检测方法有了很大提高、受检 样本多等特点，然而目前我国弓形虫病诊断试剂 盒品种繁杂，质量参差不齐，无统一标准，给弓 形虫病的Baidu Nhomakorabea断与防治造成严重危害。
• 双抗体夹心ELISA
间接ELISA
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目前研究表明ELISA具有敏感性高、特异性强、 检测速度较以往的检测方法有了很大提高、受检 样本多等特点，然而目前我国弓形虫病诊断试剂 盒品种繁杂，质量参差不齐，无统一标准，给弓
小结
• 我国宠物数量巨大，宠物弓形虫病研究还刚起 步，应加强宠物弓形虫病的调查研究，掌握弓形 虫病的流行规律，建立适合于环境污染评价和宠 物弓形虫病诊断的新型检测技术，随着弓形虫病 原学分子生物学流行病学的深入研究，弓形虫检 测技术及疫苗研究的不断发展，对于弓形虫感染 途径和预防策略会有更进一步的认识，其感染率 可望逐渐下降。
犬猫弓形虫防治
• 预防措施 a 加强宠物养护知识的培训和宣传，增强群防群治 意识 b 加强宠物市场管理及兽医检疫制度建设 c 提高自我防护意识．不与宠物有过分亲密的接触
d 疫苗研究进展 弓形虫疫苗种类繁多，具体可分为：全虫疫苗； 虫体特异组分疫苗；基因工程疫苗；核酸疫苗。 弓形虫病疫苗从最早采用的死虫疫苗已发展到核 酸疫苗、基因工程疫苗及活载体疫苗。基因工程 疫苗生产过程复杂，技术难度大，生产成本高， 免疫活性也不太理想，从而限制了此类疫苗的推 广应用。 近几年来，核酸疫苗又成为国内外学者新的研 究热点。目前，核酸疫苗技术已在利什曼原虫、 疟原虫等的疫苗研制中得到尝试及应用，显示出 良好的保护作用，而弓形虫核酸疫苗的研制尚处 于起步阶段。
犬猫弓形虫病的诊断及防控
主要内容
• 弓形虫病概述 • 弓形虫病的实验室诊断 • 犬猫弓形虫防治
• 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫。属于孢子 虫纲、真球虫目、弓形虫科。因其虫体呈弓形，故命名 为刚地弓形虫。在弓形虫生活史中有五个不同形态阶段 即速殖子、包囊、裂殖体、配子体和卵囊，其中对人体 具致病或传染性的阶段为速殖子、包囊和卵囊。
• 弓形虫的生活史
弓形虫的整个生活史发育需要经过2个宿主,猫科动物为终末 宿主，人和其他动物为中间宿主。
弓形虫病的实验室诊断
• 病原学诊断
• 免疫学诊断
• 分子生物学诊断
• 病原学诊断 a 直接涂片或组织切片检 查法 将所采集的检查病料 直接涂抹或压印在玻 片上，用姬氏染液或 瑞氏染液染色镜检。 发现典型的新月形滋 养体或组织包囊可确 诊。此法诊断弓形虫 病非常准确，但检出 率低。
• 分子生物学诊断
1 核酸分子杂交(DNA探针技术)
核酸分子杂交技术是用一定的示踪物对特定 基因序列的核酸片段进行标记，通过与待测样本 中互补片段的特异性结合来进行诊断。由于核酸 分子杂交的高度特异性和检测方法的高度灵敏性， 使得该技术成为分子生物学领域内应用最广泛的 基本技术之一。20世纪80年代末，DNA探针检测弓 形虫病的方法应用较多。 从探针来源看，目前用于弓形虫检测的探针 多为特异性DNA克隆片段或人工合成的寡核苷酸探 针，但其制备需要一定条件，费用较高。
2 聚合酶链式反应（PCR） PCR是近年来学者们研究的热点之一，已广泛 应用于弓形虫DNA的检测，具有敏感、特异、检测 迅速等优点。PCR成功与否的关键在于特异而敏感 的引物的选取。目前，常用的检测弓形虫的靶基 因有P 3O基因、B 1基因、529 bp片段,它们在弓 形虫基因组中均具有高度保守的特点。
弓形虫病概述
• 弓形虫病(Toxoplasmosis) 是由刚地弓形虫 (Toxoplasma gondii)感染而引起的一种呈世界性 分布且严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。 • 犬猫可以感染并传播弓形虫病，随着家养宠物逐 渐增多，人与宠物密切接触，人群弓形虫的感染 率亦逐年上升。全球估计约有三分之一的人口感 染，中国（2004年）人群平均感染率亦达到7.88%。
4 基因芯片技术 基因芯片(genechip) 又称DNA 微阵(DNA mic roa rra y)或DNA 芯片(DNA c hip), 它是指按特 定排列方式固定有大量基因探针的硅片、玻片或 塑料片, 借助核酸分子杂交的特性对DNA 样品的 序列信息进行高效解读和分析。具有高通量、平 行性的特点，可同时对多种疾病进行检测。该技 术已在弓形虫致病机理，分析其感染过程宿主基 因表达谱等基础研究中广泛应用。
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另外，PCR技术与免疫学检测技术相结合，又出 现了PCR—ELISA及免疫PCR(I—PCR)的新技术，具 有PCR的灵敏性、核酸杂交的特异性及ELISA的酶 联放大作用，故而检测结采更灵敏、更准确。
3 单克隆抗体技术 单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)是用经 特异性抗原刺激的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞杂交、 融合后分泌的一种单一的特异性抗体。McAb具有 高度特异性与同质性，以McAb为探针可对特定靶 抗原进行识别、分析，以及鉴定抗原的免疫反应 性。McAb作为诊断试剂，虽具有高度特异性，且 易于标准化，但由于McAb识别特异性决定簇的特 点可能导致缺乏足够敏感性。
形虫病的诊断与防治造成严重危害。
c 间接荧光抗体试验（IFAT） 是以完整的弓形虫为抗原，采用荧光标记的二 抗检测特异 IgM和IgG。 IFA具有简便、快速、敏感、特异和重复性强 等优点，检测弓形虫表面膜抗原的特异性抗体IgM 和 IgG。感染后的第7天至第8天，首先出现IgM， 持续数周至数月，如果IgM水平升高，提示有近期 感染。