遗传代谢性疾病的基因诊断优秀课件
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基本流程：第4步
反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase 的作用下发生降解。
dNTP
ATP双磷酸酶
dNDP+dNMP+Pi
ATP
ATP双磷酸酶 ADP+AMP+Pi
返回节
基本流程：第5步 加入另一种dNTP，使
第2－4步反应重复进 行，根据获得的峰值 图即可读取准确的DNA 序列信息
遗传代谢性疾病的基因诊断优 秀课件
主要内容
前言 一、基因诊断技术 二、遗传代谢性疾病的基因诊断
前言
细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须 依赖不断进行的物质代谢过程。
物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。 代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白
异常所致。 根据代谢性疾病的病因，可将其分为原发性和继发
DNA 序列
G
C
-
A GG CC T
GC
T
A
G
C
T
核苷酸递增
返回节
焦磷酸盐测序法步骤
返回节
二、聚合酶链反应技术
PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的方法。
四种主要成分： DNA模板、引物、DNA 聚合酶和dNTP。
三个反复步骤： 高温变性、低温退火和 适温延伸。
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三、毛细管电泳技术
毛细管电泳统指以高压电场为驱动力， 以毛细管为分离通道，依据试样中各组 分间淌度和分配行为上的差异来实现分 离的一类分离技术。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ性。
一、代谢性疾病的分类 二、代谢性疾病的诊断手段
返回章
一、代谢性疾病的分类
原发性代谢性疾病： 又叫先天性代谢性疾病。是指当编码物质代谢所需酶
或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活性的 产物时，就会导致有关代谢途径不能正常运转，造成 具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。 继发性代谢性疾病：
继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代谢性 疾病，如糖尿病导致的继发性高脂血症。
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二、代谢性疾病的诊断手段
过去：主要依靠与物质代谢相关的各种酶的 生物化学方面的诊断
现在：生化诊断+基因诊断
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基因诊断的概念
基因诊断就是利用现代分 子生物学和分子遗传学的技 术方法,直接检测基因结构及 其表达水平是否正常,从而对 疾病作出诊断的方法。
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基因诊断的特点
针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强 诊断范围广
基本原理是根据在电场作用下离子迁移 的速度不同而对组分进行分离和分析。
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变性高效液相色谱(DHPLC)是一种新的 高通量筛选DNA序列变异的技术，其原 理是利用离子对反向高效液相色谱原理, 通过一个DNA分离柱，进行核苷酸片段 的分离和分析。
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四、基因芯片技术
基因芯片技术就是指将大量特定的靶基因片段或 寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列固定 于玻璃和硅等固相载体上，然后检测与待测的不 同荧光标记样品基因按碱基配对的原理进行杂交， 通过激光共聚焦系统检测探针分子的杂交信号强 度，经计算机分析处理数据资料，获取不同样品 分子的数量和大量生物信息，从而可对基因序列 及功能进行大规模和高通量的研究。
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA…… GGATCTT……
TT AA
dNTP Apyrase
(d)NMP
PPi ATP-sulphurylase
ATP Luciferase
Light
C
T
GC
A G TC A G TC AG TC A G TC
返回节
基本流程：第1步 一个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入
返回节
第一节 基因诊断技术
一.DNA测序技术 二.聚合酶链反应技术 三.毛细管电泳技术 四.基因芯片技术
返回章
一、DNA测序技术
所有生物基因组序列的数 据均来自 DNA 测序 特点: 稳定简便 自动化程度高 数据准确可靠 公认为国际金标准
返回节
双脱氧链终止法
原理: 测序基础是以ddNTP
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第二节 遗传代谢性疾病的基因诊断
遗传代谢性疾病是指由于基因突变导致酶的质和量的改变， 从而所催化的酶促反应发生变化而引起的一系列疾
病。
一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略
二、苯丙酮酸尿症（PKU) 八、家族性高脂蛋白血症
三、同型胱氨酸尿症(HCU) 九、肝豆状核变性
四、酪氨酸血症 五、半乳糖血症
为测序反应的链终止剂 掺入到延伸链中的
ddNTP可阻止后续 ddNTP或dNTP的掺 入
返回节
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示例：BigDye™ Terminators 循环测序反应扩增到未端为BigDye™ Terminators
的一系列的核苷酸链。 循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化，从而去除多
余的未反应的BigDye™ Terminators。 电泳与结果分析。
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焦磷酸测序技术
原理: 引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP
硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种 酶的协同作用下，将每一个dNTP的聚合与一次荧 光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强 度，以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷 酸序列。
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A
B
DNA Polymerase
十、先天性甲状腺功能低下 十一、溶酶体病
六、糖原累积症
十二、线粒体病
七、果糖不耐症
返回章
一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略
遗传代谢性疾病的病理生理改变特征
代谢途径的某些终末产物缺乏 受累代谢途径中间和或旁路代谢产物大量蓄积 由于代谢连径受阻而导致对肝、脑、肌肉等蛆织
能量供应不足
(DNA)n+dNTP
聚合酶
(DNA)n+1+PPi
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基本流程：第3步 在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形
成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧 光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD 光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值高低则和相 匹配的碱基数成正比。
酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、 Luciferase和三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase)和底物混合 物(包括腺苷酰硫酸APS和Luciferin)。
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基本流程：第2步
向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模 板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下， 添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷 酸(PPi)。
基本流程：第4步
反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase 的作用下发生降解。
dNTP
ATP双磷酸酶
dNDP+dNMP+Pi
ATP
ATP双磷酸酶 ADP+AMP+Pi
返回节
基本流程：第5步 加入另一种dNTP，使
第2－4步反应重复进 行，根据获得的峰值 图即可读取准确的DNA 序列信息
遗传代谢性疾病的基因诊断优 秀课件
主要内容
前言 一、基因诊断技术 二、遗传代谢性疾病的基因诊断
前言
细胞、组织、器官和机体的生存与功能维持都必须 依赖不断进行的物质代谢过程。
物质代谢包括合成代谢及分解代谢两个过程。 代谢性疾病是物质代谢过程的紊乱，多为酶或蛋白
异常所致。 根据代谢性疾病的病因，可将其分为原发性和继发
DNA 序列
G
C
-
A GG CC T
GC
T
A
G
C
T
核苷酸递增
返回节
焦磷酸盐测序法步骤
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二、聚合酶链反应技术
PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的方法。
四种主要成分： DNA模板、引物、DNA 聚合酶和dNTP。
三个反复步骤： 高温变性、低温退火和 适温延伸。
返回节
三、毛细管电泳技术
毛细管电泳统指以高压电场为驱动力， 以毛细管为分离通道，依据试样中各组 分间淌度和分配行为上的差异来实现分 离的一类分离技术。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ性。
一、代谢性疾病的分类 二、代谢性疾病的诊断手段
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一、代谢性疾病的分类
原发性代谢性疾病： 又叫先天性代谢性疾病。是指当编码物质代谢所需酶
或蛋白的基因发生突变、不能合成或合成了无活性的 产物时，就会导致有关代谢途径不能正常运转，造成 具有不同临床表型的各种代谢缺陷病。 继发性代谢性疾病：
继发性代谢性疾病是由其它原发性疾病导致的代谢性 疾病，如糖尿病导致的继发性高脂血症。
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二、代谢性疾病的诊断手段
过去：主要依靠与物质代谢相关的各种酶的 生物化学方面的诊断
现在：生化诊断+基因诊断
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基因诊断的概念
基因诊断就是利用现代分 子生物学和分子遗传学的技 术方法,直接检测基因结构及 其表达水平是否正常,从而对 疾病作出诊断的方法。
返回节
基因诊断的特点
针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强 诊断范围广
基本原理是根据在电场作用下离子迁移 的速度不同而对组分进行分离和分析。
返回节
变性高效液相色谱(DHPLC)是一种新的 高通量筛选DNA序列变异的技术，其原 理是利用离子对反向高效液相色谱原理, 通过一个DNA分离柱，进行核苷酸片段 的分离和分析。
返回节
四、基因芯片技术
基因芯片技术就是指将大量特定的靶基因片段或 寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列固定 于玻璃和硅等固相载体上，然后检测与待测的不 同荧光标记样品基因按碱基配对的原理进行杂交， 通过激光共聚焦系统检测探针分子的杂交信号强 度，经计算机分析处理数据资料，获取不同样品 分子的数量和大量生物信息，从而可对基因序列 及功能进行大规模和高通量的研究。
ACCTTGAATTCGTCCTAGGA…… GGATCTT……
TT AA
dNTP Apyrase
(d)NMP
PPi ATP-sulphurylase
ATP Luciferase
Light
C
T
GC
A G TC A G TC AG TC A G TC
返回节
基本流程：第1步 一个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入
返回节
第一节 基因诊断技术
一.DNA测序技术 二.聚合酶链反应技术 三.毛细管电泳技术 四.基因芯片技术
返回章
一、DNA测序技术
所有生物基因组序列的数 据均来自 DNA 测序 特点: 稳定简便 自动化程度高 数据准确可靠 公认为国际金标准
返回节
双脱氧链终止法
原理: 测序基础是以ddNTP
返回节
第二节 遗传代谢性疾病的基因诊断
遗传代谢性疾病是指由于基因突变导致酶的质和量的改变， 从而所催化的酶促反应发生变化而引起的一系列疾
病。
一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略
二、苯丙酮酸尿症（PKU) 八、家族性高脂蛋白血症
三、同型胱氨酸尿症(HCU) 九、肝豆状核变性
四、酪氨酸血症 五、半乳糖血症
为测序反应的链终止剂 掺入到延伸链中的
ddNTP可阻止后续 ddNTP或dNTP的掺 入
返回节
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示例：BigDye™ Terminators 循环测序反应扩增到未端为BigDye™ Terminators
的一系列的核苷酸链。 循环测序反应产物经沉淀、洗涤和纯化，从而去除多
余的未反应的BigDye™ Terminators。 电泳与结果分析。
返回节
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焦磷酸测序技术
原理: 引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP
硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种 酶的协同作用下，将每一个dNTP的聚合与一次荧 光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强 度，以荧光信号的形式实时记录模板DNA的核苷 酸序列。
返回节
A
B
DNA Polymerase
十、先天性甲状腺功能低下 十一、溶酶体病
六、糖原累积症
十二、线粒体病
七、果糖不耐症
返回章
一、代谢性疾病的特征及基因诊断策略
遗传代谢性疾病的病理生理改变特征
代谢途径的某些终末产物缺乏 受累代谢途径中间和或旁路代谢产物大量蓄积 由于代谢连径受阻而导致对肝、脑、肌肉等蛆织
能量供应不足
(DNA)n+dNTP
聚合酶
(DNA)n+1+PPi
返回节
基本流程：第3步 在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形
成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧 光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD 光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值高低则和相 匹配的碱基数成正比。
酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、 Luciferase和三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase)和底物混合 物(包括腺苷酰硫酸APS和Luciferin)。
返回节
基本流程：第2步
向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模 板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下， 添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷 酸(PPi)。