藻类对重金属胁迫的生理响应机制

藻类对重金属胁迫的生理响应与解毒机制
作者：黄鹤忠，学号：D05032，导师：梁建生
摘要：重金属是一类具有潜在危害的重要污染物，越来越多的重金属被排入水体，对水生生态环境构成严重威胁。

藻类在长期响应重金属胁迫过程中，建立起一系列的适应机制。

藻类通过控制重金属的吸收、富集、转运与解毒，使不同细胞组分中的重金属维持在正常浓度范围内。

这些保护机制主要包括：藻细胞的某些胞外组分与重金属结合，从而减少重金属进入胞内；在重金属诱导下藻细胞可合成金属结合蛋白或多肽；重金属诱导藻细胞合成一些代谢物使其免受伤害或修复由重金属胁迫造成的损伤；藻细胞通过液泡区窒化作用使重金属远离代谢；藻细胞对重金属具有排斥与排出作用。

关键词：藻类，重金属，生理响应，解毒，机制
MECHANISMS FOR PHYSICAL RESPONSES AND DETOXIFICATION
TO HEAVY METAL STRESS IN ALGAE
Abstract: With the development of industry and agriculture, more and more heavy metals ale released into water bodies. Today, many heavy metals constitute a global environmental hazard. Heavy metals such as, copper, zinc and nickel are essential for many physiological processes yet can be toxic at higher levels. Other metals such as cadmium and lead are nonessential and potentially highly toxic. Algae possess a range of potential cellular mechanisms that may be involved in the detoxification of heavy metals and thus tolerance to metal stress. These include roles for tol1 follow in: for sequesteration of metals on extracellular components that reduce metal bioavailability; for chelation of metals in the cytosol by peptides and proteins; for sequestration of metals in polyphosphate bodies; for increasing the efflux or exclusion of metals; for producing stress proteins such as heat shock proteins that repair the stress damaged proteins; in addition, some heavy metals cause oxidative stress in algae, with the result that metal toxicity can be altered by synthesis of appropriate enzymes or metabolites counteracting metal- induced oxidative stress.In recent years，some attempts to engineer the production of metallothioneins(MTs) and phytochelatins(PCs) in algae to increase meta1 toleratice and/or accumulation have been reported. To date, however, it is mainly the model plant species that have been genetically engineered. The concept of phytoremediation of heavy metal contaminated water has been increasingly supported by research. Thus, studies on tolerance and detoxification mechanism of heavy metal in algae have numerous ecological and public health implications.
Keywords：Algae, heavy metals, physical responses, detoxification, mechanisms
1 水体重金属污染的现状
随着城市化进程的加快和工农业的迅猛发展，大量未经处理的城市垃圾、污染的土壤、工业和生活污水，以及大气沉降物不断排入水中，使水体悬浮物和沉积物中的重金属含量急剧升高。

虽然河流和海域的沉降物对排入水中的金属类污染物有强烈的吸附作用，但是当水体pH值、Eh(氧化还原电位)等环境条件发生变化时，吸附的污染物又会释放出来，导致水环境重金属的进一步污染[1]。

据
2005年《中国海洋环境质量公报》，我国海域总体污染状况仍未好转，近岸海域污染形势依然严峻。

2004年和2005年我国全海域未达到清洁海域水质标准的面积约13.9万平方公里，严重污染海域仍主要分布在辽东湾、渤海湾、莱州湾、锦州湾、长江口、杭州湾、江苏近岸、珠江口和部分大中城市近岸局部水域。

我国大部分河口、海湾的海水铅含量超过一类水质标准；部分重点海域汞含量较高；个别重点海域的镉含量偏高。

例如，华秀红等[2]对启东海域海洋生物污染的调查结果表明，所测定鱼、贝、虾蟹样品中，重金属Pb的含量高于I类污染值的超标率达7l％、重金属Cd的I类污染值超标率达
78.6％，特别是枇杷虾的镉含量均超过了Ⅱ类污染的标准值，塘芦港的枇杷虾中含量甚至高达l5.3 mg／kg，超过了Ⅲ类污染值的3倍。

重金属是造成水体污染的一类有毒物质，微量的重金属即可产生毒性效应，某些重金属还可以在微生物的作用下转化为毒性更强的难以被生物降解的金属化合物，在食物链的生物放大作用下大量富集，最后进入人体[3]。

污染水体的汞、砷、镉、铅、铬等重金属元素通常对藻类有较高毒性，甚至植物必需的痕量元素铜、锌、镍等在较高浓度时也能对藻类产生明显的毒性效应。

这些重金属元素可与蛋白质结合引起其活性丧失或结构破坏，取代某些必需微量元素从而导致营养缺乏，以及诱导自由基或活性氧的生成[4]。

2 研究藻类对重金属胁迫的生理响应与解毒机制的必要性
藻类是水体的初级生产者，在水生生态系统的食物链中起着十分重要的作用。

重金属通过各种途径进人水体后，一旦被藻类吸收，将引起藻类生长代谢与生理功能紊乱，抑制光合作用，减少细胞色素，导致细胞畸变、组织坏死，甚至使藻类中毒死亡，改变天然环境中藻类的种类组成。

通过分析水生藻类的种类和数量组成，研究其生理、生化反应及积累毒物的特点，可以准确地判断水体的污染性质和污染程度。

在多种污染物并存时，藻类能通过不同的反应症状指示多种干扰效应来综合反映环境质量状况，可实现高灵敏度连续监测和早期预报，而且能监测小剂量和长期作用产生的污染物的慢性毒性效应。

藻类作为水体污染的有效参照物，利用藻类对重金属的耐性及解毒生物指示物或生物标志物进行水污染生物监测一直是研究的热点之一。

藻类在长期响应重金属胁迫过程中，也建立起一系列的适应机制。

近年来，人们通过研究藻类对重金属的耐性机制，提出将藻类用于生物修复水体重金属污染，这方面的工作也倍受关注。

因此，研究藻类对重金属胁迫的生理响应机制有着重要的意义。

3 藻类对重金属的生理生化响应
重金属对藻类生理生化功能影响的研究侧重于藻类的光合作用、碳代谢和藻类DNA、RNA、蛋白质合成及酶活性等方面。

Fillippis[5]报道在藻类培养基中添加HgCl2之后，小球藻的RNA、DNA及蛋白质与同样条件下的水平相比有所提高；相反，添加醋酸苯汞脂则引起RNA、DNA和蛋白质的水平下降，他们还发现：(同样条件下)小球藻的干重大量增加，这可能是由于乙醇酸盐的排泄途径受阻所致。

林碧琴、张小波[6]试验表明：在非致死浓度范围内(0.25～1.5mg／L CdCl2)随Cd浓度增加其DNA酶、脱氢酶、过氧化物酶活性受到强烈的影响，细胞分裂、光合放氧和细胞膜透性受到强烈抑制。

推测重金属影响酶活性的机理：一种可能是由于重金属的作用使作为酶的辅助因子的金属离子的吸收和利用受阻；另一种可
能是重金属与酶蛋白的某些结合形成螯合物，使酶的结构与构型发生变化而影响酶的活性。

Davies[7]观察到，Hg浓度为10mg／L时，使杜氏藻形成巨细胞，而不进行分裂。

他认为这是由于生长和分裂解偶联，抑制了蛋氨酸的合成。

Davies和Sleep[8]证明：较低浓度的Zn会抑制浮游植物群落的光合作用，Zn还会导致细胞膜透性增加，使电解质漏失；高浓度的Zn会抑制各种藻类生长、并使叶绿素含量下降，以致类胡萝素与叶绿素的比例失调。

姜彬慧、林碧琴[9]报道，当Ni2+浓度≥
0.4mg/L 时，Arkistrodesms sp.的生长受到明显抑制，其生长滞期延长、光合作用受阻、细胞膜透性增加；当Ni2+浓度为3.2mg/L时，其蛋白质氨基酸的含量明显下降。

孔繁翔[10]在研究了不同浓度的Ni、Zn、Al对羊角月芽藻的生长速度、蛋白质含量、ATP水平、葡萄糖磷酸脱氢酶(G6PDH)、酸性磷酸酶及硝酸还原酶活性的影响。

结果表明，3种金属离子在所试浓度范围内对羊角月芽藻的生长速度均有抑制作用，但单位藻培养物中蛋白质随着金属离子浓度的增加而增加；高浓度金属离子对酶活性有明显抑制作用；藻细胞中ATP水平随着金属离子浓度的增加而下降，说明重金属离子的存在会导致藻细胞内能量代谢的变化，从而提出了重金属离子对藻类产生影响的可能机理是：高浓度重金属离子的存在，打破了生物最佳的各种营养元素(氮和磷等)生物可利用性的平衡。

浩云涛和李建宏等[11]研究了一株高重金属抗性的椭圆小球藻在Cd2+胁迫下的生理变化。

结果显示，在10-240umol/L浓度的Cd2+胁迫下，随着金属离子浓度提高，叶绿素的总量减少，光合放氧受到抑制。

Cd2+离子浓度的提高，导致了氧自由基的大大增加，同时脯氨酸、SOD以及POD水平均大大提高。

提示，这些与消除自由基有关的代谢产物的积累，有利于细胞减少胁迫造成的损伤；CAT对Cd2+敏感，其活性与胁迫浓度呈负相关。

王山杉等[12]对在不同Zn2+浓度条件下培养的固氮鱼腥藻(Anabaena azotica Ley)的生长、光合放氧速率和叶绿素荧光参数Fv/Fm进行了测定。

结果表明，当Zn2+ 浓度为1.0umol/L时，其比生长速率最大，光合放氧速率和Fv/Fm值最高。

当Zn2+ 浓度大于等于5.0umol/L时，会抑制A．azotica的生长和光合作用；在5.0umol/L Zn2+生长的藻细胞藻胆体-类囊体膜复合物吸收光谱(624nm处藻胆体的吸收峰)和在5.0umol/L Zn2+发生反应的藻蓝蛋白溶液的可见光吸收光谱(620nm 处藻蓝蛋白的吸收峰)都因Zn2+的作用而下降，推测藻蓝蛋白为Zn2+ 影响光合作用的位点之一。

碳酸酐酶活性的测定表明，Zn2+ 的浓度水平会影响其活性大小，推测Zn2+是影响光合作用的另一途径。

杨艳华等[13]研究了不同浓度Cd2+对黑藻(Hydrilla verticilla)叶光化学及硝酸还原酶特性的影响，结果表明：随着Cd2+浓度的增加，黑藻叶片的叶绿素含量、叶绿素a和b比值、PSI、PSⅡ及全电子链的活性皆呈现下降的趋势；而其叶绿体ATP的含量、硝酸还原酶的活性、类囊体膜的室温吸收光谱和室温荧光发射光谱则呈现先上升后下降的趋势。

实验表明：可根据黑藻叶光化学及硝酸还原酶特性的变化来监测环境中Cd2+污染的程度。

张小兰等[14]研究了不同浓度的Hg2+、Cd2+离子单一处理对轮藻(Chara)藻体叶绿素含量，叶绿素a/b 比值，可溶性蛋白含量、SOD、POD、CAT活性的影响。

结果表明，受Hg2+、Cd2+胁迫后，随着Hg2+、Cd2+浓度的增加，叶绿素含量、叶绿素a/ b 比值、可溶性蛋白含量持续下降；Hg2+处理系列的SOD 活性呈下降趋势，而Cd2+ 处理系列则表现出先降后升再降趋势；两种离子处理POD 活性都表现出先明显上升后下降的相同情况，但幅度不同；CAT 活性受两种离子的影响存在明显不同。

实验结果表明，在相同处理浓度和处理时间条件下，Hg2+比Cd2+对轮藻的毒性要大。

罗通等[15]研究了Ag+、Pb2+对轮藻生理生化指标的影响，结果表明，随重金属胁迫剂量的加大，轮藻叶绿素含量、CAT、POD 及SOD活性、可溶性蛋白含量呈倒“Ⅳ”形规律变化，即降—升—降的变化，这和在重金属诱导下，
轮藻自身的防御机制运行有关，Ag+和Pb2对轮藻的胁迫效果不同。

苏秀榕等[16]的研究证实，在Cu 、Cd 和Zn 的作用下，三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、湛江叉鞭藻(Dicrateria Zhanjiangnesis)、绿色巴夫藻(Pavlova viridis)、青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)、小球藻(Chlorella sp.)等单细胞藻酯酶基因表达发生明显的变化，受高浓度的Cu2+胁迫时三角褐指藻的Est-3座位的a基因，受中等浓度Cd2+胁迫时湛江叉鞭藻的Est-3座位的b基因，受低等浓度Cd2+胁迫时的绿色巴夫藻的Est-1座位的a、b两个基因，受高浓度Zn2+胁迫时绿色巴夫藻Est-1座位的b基因，受中低浓度的Cd2+、Zn2+和低浓度的Cu2+胁迫时小球藻的Est-2座位的b基因等基因的表达明显增强；而绝大部分位点的基因表达受3种离子的抑制。

藻类对重金属胁迫的生理生化响应还受到各种环境因素直接或间接的影响，其中主要的环境因素有水中的酸碱度(pH值)、温度、光照、磷酸盐及螯合剂等。

水体pH值和氧化还原电位势是影响金属在水中迁移转化的两个重要的理化因素，温度是环境中金属离子浓度和金属对藻类毒性的调节因素之一。

4 藻类细胞壁及表面与重金属的结合
藻类对重金属的吸收包括胞外的快速吸附与胞内的缓慢富集两个阶段[17]。

第一阶段是重金属被吸附到藻细胞表面，在多数情况下，约80％—90％的重金属被吸附到藻细胞表面[18-20]，藻类细胞壁含有一些功能基团如羟基、羧基、氨基、巯基和磷酸根等[21-22]，因而细胞壁带负电荷，通过离子交换或其它机制可以与水中的重金属离子结合。

该过程迅速而且可逆，吸附到藻细胞表面的重金属可被EDTA等螯合剂洗脱；而第二阶段是重金属跨膜进入胞内富集的过程。

5 金属结合蛋白(或多肽)与藻类重金属耐逆性
5.1 植物络合素
植物络合素(phytochelatins；PCs)是一类由重金属离子诱导的、酶促合成的富含半胱氨酸的小分子多肽，结构式为(γ-Glu-Cys)n-Gly，其中n=2-11(通常为2-5)。

PCs有许多结构变体。

PCs广泛分布于单子叶植物、双子叶植物、藻类及真菌中[23]，尚未见报道动物能合成PCs。

5.1.1 植物络合素的生物合成
PCs在结构上与谷胱甘肽(γ-Glu-Gys-Gly；GSH)相似，生理、生化和遗传学研究已证实GSH是合成PCs的底物。

PCs由γ-谷氨酰半胱氨酸二肽基转移酶(γ-glutamylcysteine dipeptidyl transpeptidase，EC 2.3.2.15)即植物络合素合酶(phytochelatin synthase；PCS)以GSH为底物催化合成，而PCS受重金属离子激活[23-24]。

5.1.2 藻类植物络合素的功能
到目前为止，尚未见报道表明重金属能诱导原核藻类合成PCs，诱导真核藻类产生PCs的重金属有Cd、Cu、Zn、Pb、Hg、Ni和Ag等。

离体实验结果表明，PC可作为过氧化氢和超氧阴离子自由基的清除剂，能减轻氧化胁迫[26]。

Morelli等用排斥色谱(SEC)、原子吸收光谱(AAS)及高效液相色谱(HPLC)研究海洋硅藻Phaeodactylum tricomutum的Cd-PCs复合物，发现该藻中存在两类Cd-PCn复合物，一类是特定链长的肽与Cd形成的复合物(Cd-PCn，n=2-6)，另一类是具有酸活性的S2-结合到Cd-PCn复合物形成的含Cd-S微晶(crystallites)的PC复合物，其分子量大于前者，这表明该复合物结合了更多Cd。

Morelli
和Scarano[27]用Cd和Pb处理P. tricornutum，后转入无Cd和Pb的培养基，结果发现PC含量下降，GSH 含量上升，说明该条件下重金属-PCs复合物发生了降解。

并非所有的真核藻类都能合成PCs，Satoh等[28]用HgCl2处理绿藻Tetraselmis tetrathele，
结果没有检测到PCs，但发现另一种三肽Arg-Arg-Glu，它能结合Hg2+。

5.2 金属硫蛋白
5.2.1 金属硫蛋白的分子结构
金属硫蛋白(metallothioneins；MTs)是一类基因编码的低分子量富含半胱氨酸的金属结合蛋白
[29]，已在动物、植物和蓝藻Synechococcus中发现[30]。

根据MT中半胱氨酸的排列，将MT分为三类：Class
I MTs含有20个高度保守的半胱氨酸残基，广泛分布于脊椎动物中；Class II MTs中半胱氨酸没有严格的排列，真菌、植物和无脊椎动物中的MT均属于此类；Class III MTs即前述PCs。

5.2.2 藻类金属硫蛋白的功能
目前，有关藻类MT的研究主要集中于蓝藻聚球藻属(Synechococcus)。

MT能通过巯基与重金属离子结合，从而降低重金属的毒性。

最近的研究表明，颤藻Oscillatoria brevis利用重金属转运体将过多的金属离子快速输出细胞作为第一道防线，利用金属硫蛋白螯合重金属作为第二道防线，以缓冲并贮存过多的重金属，从而提高对重金属的耐性[31]。

另外，MTs也富含巯基，是否具有清除细胞内自由基的作用也有待探讨。

因此，要真正阐明MTs在蓝藻重金属耐性方面的作用还需进行深入细致的研究。

5.3 谷胱甘肽
谷胱甘肽(GSH)是机体内非蛋白硫醇的主要来源，含有巯基，能与重金属直接结合，同时GSH又是合成PCs的底物。

经重金属处理后藻细胞中PCs合成增加，GSH含量下降，这有利于减轻GSH的反馈抑制，提高γ-ECS活性。

重金属处理2h后，硅藻Phaeodactylum tricornutum细胞中约50％的GSH用于合成PCs[32]。

谷胱甘肽不仅是PCs合成的底物，亦是机体内重要的抗氧化物质。

重金属胁迫会诱导活性氧的产生，导致生物体氧化损伤[33]。

铜胁迫条件下绿藻Scenedesmus bijugatus中GSH被逐渐消耗，γ-ECS、GSH硫转移酶、GSH过氧化物酶活性提高，而GSSG还原酶活性降低；铜胁迫初始阶段过氧化氢升高，后来则降低[34]。

6 细胞内多磷酸体对重金属的络合作用
多磷酸体(polyphosphate bodies；PPB)是正磷酸盐的聚合物，含有大量K+、Na+、Ca2+、Mg 2+等金属阳离子，它不仅具有储存磷的功能，而且对重金属具有解毒作用。

在重金属胁迫条件下，多磷酸体的数量会增加[35]，提高磷浓度可减轻重金属对藻类的毒害[36]。

应用x射线能谱分析表明，Pb 在Diatoma tenue中的富集[37]以及Cd、Cu、Co、Hg 、Ni、Pb和Zn在Plectonema boryanum中的富集[38]也与多磷酸体有关。

多磷酸体虽然具有解毒作用，但在磷缺乏条件下，它会释放正磷酸盐以满足代谢需要，相应地多磷酸体结合的重金属也被释放，因而可能对藻细胞产生重金属毒害。

因此，必须满足藻类对磷的需求，多磷酸体才能发挥解毒作用。

至今研究表明：提高环境磷含量在降低Zn、Cu、甲基汞、Fe、Ni等对不种的蓝藻、绿藻、硅藻的解毒方面起着重要的作用。

7 脯氨酸在藻类抗重金属胁迫中的作用
在逆境条件下，生物体会积累脯氨酸，重金属胁迫能引起藻类积累脯氨酸。

Wu等[39]用Cu和Cd处理四种藻(2种绿藻、1种硅藻和1种蓝藻)，结果显示：耐性种类比敏感种类积累更多脯氨酸，补充外源脯氨酸能明显降低Cu对蓝藻Anacystis nidulans的损伤；脯氨酸可减少胞内钾离子泄漏，胞内脯氨酸积累可能与防御渗透改变的保护机制有关。

脯氨酸猝灭单线态氧或直接与羟自由基反应，将减少自由基对细胞造成的损伤，维持细胞内更多的还原环境(reducing environment)，使得GSH含量升高，而高的GSH含量又促进PCs合成及其与重金属的螯合，从而提高细胞对重金属的耐性或解毒能力。

8 热激蛋白与藻类重金属耐性
热激蛋白(Heat shock protein，Hsps)按照其SDS电泳的表观分子量大小，可以把植物Hsps分为五大类：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子量热激蛋白(smHSP)，每一类Hsps在结构上都具有不同程度的保守性，它们在生理代谢或胁迫响应中行使不同的功能。

每种植物体一般含有几类Hsps，但在胁迫条件下可能只有一种Hsps起主导作用[40]。

许多胁迫因子如高温、低温、重金属离子等都可以诱导Hsps合成，在胁迫条件下修复变性的蛋白质或保护其它蛋白质免受损伤。

Bierkens等[41]用ZnCl
Raphidocelis subcapitata，发现二者可显著诱导Hsp70合成。

重金属2和SeO2等处理绿藻
胁迫下热激蛋白的协同作用可能在清除重金属变性蛋白质、维持细胞的正常代谢和提高细胞的重金属抗性方面有重要作用。

今后需要更多的实验来阐明Hsp70在藻类重金属胁迫中的具体功能。

9 液泡区室化作用
液泡区室化作用(vacuolar compartmentalization)在高等植物对重金属的耐性和解毒中起着重要作用[42]。

Heuillet等[43]应用x射线显微分析的方法研究Dunaliella bioculata，Cd暴露20天后在液泡里发现了Cd和S，但暴露3天时在液泡中未检测到Cd的存在。

Nassiri等[44]在处于Cu和Cd胁迫条件下的Skeletonema costatum的液泡中也检测到了Cd和S，并发现受重金属胁迫的细胞液泡体积增大，Cu在液泡中较Cd富集少。

藻类细胞液泡中硫的存在，可能是由于低分子量的重金属-PCs复合物结合硫之后所形成的高分子量重金属-PCs复合物进入液泡所致。

因此，液泡区室化作用在藻类耐受重金属胁迫方面可能也是重要的解毒方式之一，至于藻类液泡如何螯合重金属以及重金属-植物络合素出入液泡的机理尚有待深入研究。

10 藻类对重金属的排斥和排出作用
藻类细胞能以多种方式减少重金属的进入：(1)膜功能的改变，重金属可导致膜透性降低[63]；(2)细胞壁的改变[45]。

Rai等[46]分离到Anabaena douliolum的Cu耐性株，与敏感株相比，耐性株减少了Cu2+的输入，膜完整性提高，脂含量增加。

藻类是通过主动输出还是被动扩散输出重金属目前尚有争议，但作为一种解毒机制，藻类能排出重金属已被许多研究者认同。

10 展望
涉及藻类对重金属的耐性及解毒分子机理的研究相对较少，并且还有许多未知领域．今后有必要在以下几个方面开展更多的研究工作：①鉴定和克隆重金属转运蛋白、金属伴侣蛋白，探讨重金属跨膜运输及胞内分送的分子机理；②阐明PCs在重金属转运中的作用，进一步说明重金属-PCs复合物是进入液泡用于储存还是输出细胞用于解毒或是两者兼而有之；③原核藻类中没有报道PCs的合成，而真核藻类没有报道MTs的合成，因此有必要加强原核藻类PCS基因与真核藻类MTs基因的分离鉴
定；④藻类MT 除了与Z 稳态有关，还需进一步阐明MTs的其它功能；⑤Hsps在重金属胁迫中的保护机制尚待深入探讨；⑥PCs本身含有半胱氨酸残基。

重金属PCs-高分子量复合物含硫，在某些情况下它们可能作为硫库，因此有必要研究PCs与硫代谢的关系；⑦藻类响应重金属胁迫的信号转导途径及其保护机制也是下一步
需要深入研究的一个重要领域。

高等植物中重金属能与氨基酸或有机酸(如组氨酸、柠檬酸、草酸及苹果酸)结合，从而起到解毒作用，这一点在藻类研究中尚未见报道。

另外，藻类对重金属胁迫的一系列生理上的响应，一些耐性机理有些还不清楚，一些研究结果甚至不一致，因此需要进一步从分子水平、细胞水平及机体水平进行广泛深入研究。

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