噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
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噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.5 T4噬菌体展示系统
T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中期建立起来的一种新的展示系统。它 的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表 面上的外壳蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表 面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质 变性和丢失。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示 各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制。SOC与HOC蛋白的存在与否，并不影 响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳 的表面，事实上，在DNA包装被抑制时，T4是双链DNA噬菌体中唯一能够在体内 产生空衣壳的噬菌体（SOC和HOC也同时组装）。因此，在用重组T4做疫苗时， 它能在空衣壳表面展示目的抗原，这种缺乏DNA的空衣壳苗，在生物安全性方 面具有十分光明的前景。
噬菌体展示 Phage display
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
1.什么是噬菌体展示技术？
噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PDT) 是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳 蛋白融合表 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而 编码该融合子的 DNA则位于病毒粒子内。使大量多肽 与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接 联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等） 的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.1 噬菌体结构
图1.噬菌体结构示意图
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.2 噬菌体的分类
因为噬菌体主要由蛋白质外壳和核酸组成，所以， 可以根据蛋白质外壳或核酸的结构特点对噬菌体进行分类。
根据噬菌体蛋白结构可分为：
无尾部结构的二十面体
有尾部结构的二十面体
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
线状体
按照噬菌体的核酸类型分类可分为： ss RNA：噬菌体中所含的核酸是单链RNA。 ds RNA：噬菌体中所含的核酸是双链RNA。 ss DNA：噬菌体中所含的核酸是单链DNA。 ds DNA：噬菌体中所含的核酸是双链DNA。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.3 噬菌体侵染细菌
噬菌机理噬菌体颗粒感染一个细菌细胞后可迅速生成几 百个子代噬菌体颗粒，每个子代颗粒又可感染细菌细胞，再生 成几百个子代噬菌体颗粒。如此重复只需4次，一个噬菌体颗粒 便可使几十亿个细菌感染而死亡。
（1）PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分。PV有
两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或 替换。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白 质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表 明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。 （2）D蛋白展示系统。D蛋白的参与野生型λ噬菌体头部的装配。当突变 型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况 下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源 多肽在空间上是可以接近的。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融 合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于 展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。
噬菌体除了能使宿主细菌裂解死亡外，还有一些噬菌 体感染细菌后，并不使细胞死亡，称为温和噬菌体，这些噬菌 体感染细菌后，将其自身的基因组整合进宿主细胞的基因组， 此时，这种宿主细菌称为溶原性细菌。
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3.3 噬菌体侵染大肠杆菌
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.4 λ噬菌体展示系统
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3.6 单链丝状噬菌体展示系统
丝状噬菌体是一个能够感染革兰氏阴性细菌的病毒大家族， 他们都含有单链DNA基因组，都包装于由含有几千拷贝的主要 衣壳蛋白（PⅧ）和位于顶端的次要衣壳蛋白（PⅢ）所组成的 少许柔韧性的管状衣壳中。M13和Fd噬菌体均是丝状噬菌体。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
Fra Baidu bibliotek
外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因 作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出 来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间 完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.常用的噬菌体展示系统
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
2.噬菌体展示技术的原理
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆 入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他 外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达， 融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多 肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的 识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去 未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附 的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗 脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌 体得到高度富集。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
1.1噬菌体展示技术的发展
Smith 在 1985 年首次证实外源 DNA 可以插入 丝状噬 菌体基因 III 中，并与 pIII 蛋白融合展示。 Smith GP. Science 1985; 228:1315-7
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽 Smith GP. Science.1985; 228:1315-7 1988 噬菌质粒系统 1990 抗体片段的展示 1993 展示cDNA文库 1994/1995 研发了‘phage two-hybrid’技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of phage display with high-density arrays 2001 Automated phage display selection
3.5 T4噬菌体展示系统
T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中期建立起来的一种新的展示系统。它 的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表 面上的外壳蛋白SOC（9 ku）和HOC（40 ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表 面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质 变性和丢失。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示 各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制。SOC与HOC蛋白的存在与否，并不影 响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳 的表面，事实上，在DNA包装被抑制时，T4是双链DNA噬菌体中唯一能够在体内 产生空衣壳的噬菌体（SOC和HOC也同时组装）。因此，在用重组T4做疫苗时， 它能在空衣壳表面展示目的抗原，这种缺乏DNA的空衣壳苗，在生物安全性方 面具有十分光明的前景。
噬菌体展示 Phage display
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
1.什么是噬菌体展示技术？
噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PDT) 是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳 蛋白融合表 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而 编码该融合子的 DNA则位于病毒粒子内。使大量多肽 与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接 联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等） 的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.1 噬菌体结构
图1.噬菌体结构示意图
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.2 噬菌体的分类
因为噬菌体主要由蛋白质外壳和核酸组成，所以， 可以根据蛋白质外壳或核酸的结构特点对噬菌体进行分类。
根据噬菌体蛋白结构可分为：
无尾部结构的二十面体
有尾部结构的二十面体
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
线状体
按照噬菌体的核酸类型分类可分为： ss RNA：噬菌体中所含的核酸是单链RNA。 ds RNA：噬菌体中所含的核酸是双链RNA。 ss DNA：噬菌体中所含的核酸是单链DNA。 ds DNA：噬菌体中所含的核酸是双链DNA。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.3 噬菌体侵染细菌
噬菌机理噬菌体颗粒感染一个细菌细胞后可迅速生成几 百个子代噬菌体颗粒，每个子代颗粒又可感染细菌细胞，再生 成几百个子代噬菌体颗粒。如此重复只需4次，一个噬菌体颗粒 便可使几十亿个细菌感染而死亡。
（1）PV展示系统。λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分。PV有
两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或 替换。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白 质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表 明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。 （2）D蛋白展示系统。D蛋白的参与野生型λ噬菌体头部的装配。当突变 型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况 下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源 多肽在空间上是可以接近的。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融 合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于 展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。
噬菌体除了能使宿主细菌裂解死亡外，还有一些噬菌 体感染细菌后，并不使细胞死亡，称为温和噬菌体，这些噬菌 体感染细菌后，将其自身的基因组整合进宿主细胞的基因组， 此时，这种宿主细菌称为溶原性细菌。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.3 噬菌体侵染大肠杆菌
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.4 λ噬菌体展示系统
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.6 单链丝状噬菌体展示系统
丝状噬菌体是一个能够感染革兰氏阴性细菌的病毒大家族， 他们都含有单链DNA基因组，都包装于由含有几千拷贝的主要 衣壳蛋白（PⅧ）和位于顶端的次要衣壳蛋白（PⅢ）所组成的 少许柔韧性的管状衣壳中。M13和Fd噬菌体均是丝状噬菌体。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
Fra Baidu bibliotek
外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因 作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出 来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间 完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
3.常用的噬菌体展示系统
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
2.噬菌体展示技术的原理
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆 入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他 外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达， 融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多 肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的 识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去 未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附 的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗 脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌 体得到高度富集。
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
1.1噬菌体展示技术的发展
Smith 在 1985 年首次证实外源 DNA 可以插入 丝状噬 菌体基因 III 中，并与 pIII 蛋白融合展示。 Smith GP. Science 1985; 228:1315-7
噬菌体展示技术和其通用实验技术简介
1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽 Smith GP. Science.1985; 228:1315-7 1988 噬菌质粒系统 1990 抗体片段的展示 1993 展示cDNA文库 1994/1995 研发了‘phage two-hybrid’技术 1996 首次体内in vivo 淘选试验 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体 1999 Combination of phage display with high-density arrays 2001 Automated phage display selection