土壤中纤维素分解菌

土壤中纤维素降解菌的相关研究

一、实验目的

掌握选择培养基分离细菌的方法，以及对微生物菌落观察、大小的测定、染色观察细菌的形态特征；掌握提取细菌DNA的方法、PCR技术、菌种保藏技术，从分子角度鉴定细菌；比浊法测定细菌生长曲线。

二、实验原理

土壤中含有大量的纤维素，在植物残体和有机肥中含量占干重的35%~60%，纤维素是葡萄糖高分子缩聚物，在环境中比较稳定，只有在生产纤维素酶的微生物作用下，才被分解成简单的糖类。在地球表面不同环境中发育着不同类型的分解纤维素微生物，包括真菌、细菌、放线菌的很多类群。本实验通过以纤维素为唯一碳源的培养基、对土壤中常见的纤维素降解细菌进行分离。

1.测微尺测量降解菌细胞大小

（l）镜台测微尺为一专用的载玻片，中央有精确等分线将长为1mm 的直线等分成100 个小格，每格长10μm，将细菌与镜台测微尺放在相同的显微镜放大倍数下拍照后就可以直接用照片上的镜台测微尺去测量细菌的大小（2）球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示

2.降解菌染色

简单染色：简单染色法即只用一种染料对涂片进行染色，简单易行，适用于菌体的一般形态观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。

革兰氏染色法：革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。

芽孢染色：芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行着色，从而使菌体和芽孢呈现不同的颜色。由于细菌的芽孢壁厚而致密、透性低。着色和脱色均较困难。因而需在加热条件下，用着色力强的染料促进标本着色，进入菌体的染料经水洗可脱去，而进而入芽孢内的染料难以透出，仍然保留，经复染后，菌体和芽孢可分别呈现不同的颜色。

3.降解菌菌落观察

微生物菌落即微生物聚集在一起的群体结构。在自然界中，我们肉眼所见到的微生物都是以菌落状态存在，不同种类的微生物有其特定的群体结构。因此，根据群体结构（菌落特征），我们可以初步把它们“分门别类”作粗略鉴定。通过对降解菌菌落的观察了解常见菌落的基本形态特征。

4.降解菌生物学鉴定

16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成:（1），16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA

相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断，来快速、灵敏地

检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的微生物。

（2）、PrimerA: (与E.coli16SrDNA基因位点5'端8-37位点碱基相同)

5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGG-3'

PrimerB: (与E.coli16SrDNA基因位点1479-1506位点碱基相同)

5’-ACG GCA ACC TTG TTA CGA GTT-3'

无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

冷冻干燥保存法的原理是首先将微生物冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上，从菌体中除去大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，因此可以达到长期维持生命状态的目的。

将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一般分为延缓期、对数期、稳定期及衰亡期四个时期，各时期的长短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。

比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比关系，利用光电比色计测定细胞悬液的光密度(即OD值)，用于表示该菌在本实验条件下的相对生长量。

三、实验器材

1.培养基

纤维素分解菌培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基（g/L）：

CMC-Na 20 ；Na2HPO4 2.5 ；KH2PO4 1.5 ；蛋白胨2.5 ；琼脂20 ；

pH 7.0—7.5

2.试剂及器皿

（1）无菌水、土壤样品生理盐水、石炭酸复红染色液、结晶紫染色液、路戈氏碘液、95%乙醇、番红染色液、5%孔雀绿水溶液、香柏油、二甲苯、（2）25~28℃恒温箱、显微镜、镜台测微尺、擦镜纸、载玻片、接种环、酒精灯、火柴、吸水纸、镊子

（3）XSJ-2 落射荧光显微镜、YXQ.WY21-600 灭菌锅、TH-CB-403 超净工作台、DHP-9162 恒温培养箱

斜面传代保藏法：标签试管接种环酒精灯超净台酒精冰箱无菌胶塞冷冻干燥保藏：无菌脱脂牛乳安瓶管滴管真空冷冻干燥器100ml烧杯

真空泵冰箱

培养基和试剂：200ml蛋白胨纤维素培养液（ＰＣＳ）：5.0ｇ蛋白胨，5.0ｇ纤维素（新华滤纸），5.0ｇ氯化钠，2.0ｇ碳酸钙，1.0ｇ酵母粉溶解在1L水中，接种量5%（体积分数）

器材：1mL无菌吸管、摇床、冰箱、光电比色计、标签、10支试管等。

四、操作步骤

I、土壤分解菌分离、纯化

（1）取样品：去稻田或树林有落叶处，取离地面3~5厘米处土样若干。

（2）接种：将土样揉成小土粒，放在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基，将培养基放于32℃培养3天。

（3）菌落形态观察：

（4）如需继续分离纯化，可用纤维素琼脂培养基，用稀释平板法继续进行。用已溶化至50℃羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基倒平板。用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上划线分离，而后置28℃培养3天。划线方法如图：

（一）纯化、镜检，得到纯种培养

（1）平板上出现单菌落，按无菌操作移入羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基斜面试管中，28℃培养3~4天。

（2）镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。样式以上面诉说的为准，如果不纯，继续培养。

（3）将得到纯化的菌株，已接到羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基斜面管，28℃培养3天。即获得培养菌，可冷冻保存，备用。

II、纤维素降解菌的酶活力的测定

1.试剂配制

3, 5- 二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)

称取182.0 g 酒石酸钾钠, 溶解于500 mL蒸馏水中, 加热(不超过50℃) , 于热溶液中依次加入 6.3 g 3, 5- 二硝基水杨酸、21.0 g 氢氧化钠、5.0 g 苯酚、5.0 g无水硫酸钠, 搅拌均匀至溶解, 冷却后用蒸馏水定容至1 000 mL, 储存于棕色瓶中, 室温保存, 7～10 d 后使用。

柠檬酸缓冲液：

配制0.1 mol /L的柠檬酸溶液(准确称取4.2 g 柠檬酸, 用少量蒸馏水溶解并定容至200 mL)和0.1 mol /L的柠檬酸三钠溶液(准确称取 5.88 g 柠檬酸三钠, 用少量蒸馏水溶解并定容至200 mL)。量取89.5 mL 0.1 mol /L的柠檬酸溶液和110.5 mL 0.1 mol /L的柠檬酸三钠溶液混匀, 即得pH4.85的0.1 mol /L柠