分析化学课件 PPT讲义 荧光分析法
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药物分析教研室
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
▪ 温度 ▪ 溶剂 ▪ pH值 ▪ 荧光熄灭剂 ▪ 散射光
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
荧光光谱
激发 320nm
激发350nm
荧光448nm
§2.1 荧光强度与物质浓度的关系
荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别
UV-vis
0
100%
T=0，A=∞
T=100%，A=0
关闭光闸，光不透 空白溶液，光全透
过，全吸收
过，不吸收
荧光分析法
F=0 空白溶液，不发射
荧光
F=100% 对照品溶液Cmax
F=50%(Cmid)
药物分析教研室
的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间。用f表示。
• 荧光效率(fluorescence efficiemcy)：又称荧光量子产率
(fluorescence quantum yield)是指激发态分子发射荧光的光子数 与基态分子吸收激发光的光子数之比。f
• 荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要参数！
分析化学 Analytical Chemistry
药物分析教研室
药物分析教研室
概述
• 发光(phosphorescence)：物质受到一定波长的光照射后， 外层电子跃迁后返回基态时，以光辐射的形式释放能量，这 种现象称为发光。(荧光、磷光)
• 荧光(fluorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，从 激发态的最低振动能级返回基万言书时发射出的光。
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光
振动弛豫(vibrational relexation) 内部能量转换(internal conversion) 荧光(fluorescence)发射 外部能量转换(external conversion) 体系间跨越(intersystem crossing) 磷光发射
瑞利光320nm
拉曼光谱
拉曼光360nm
瑞利光350nm 拉曼光400nm
药物分析教研室
§2 荧光定量分析方法
§2.1 荧光强度与物质浓度的关系
荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光 干扰。
荧光定量分析的依据
当A=ECl≤0.05时
荧光强度：F=Kc
激发光源 垂直方向
药物分析教研室
§2 荧光定量分析方法
§3 荧光分光光度计和荧光分析新技术
§3.1 荧光分光光度计
荧光分析仪器的主要部件 ➢激发光源：汞灯、氙灯、氘灯、溴钨灯 ➢分光系统：滤光片；单色器（光栅） ➢样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光 ➢检测器：紫外-可见（光电倍增管）
药物分析教研室
§3 荧光分光光度计和荧光分析新技术
§3.1 荧光分光光度计
药物分析教研室
第二电子 激发单重 态(S2*)
第一电子 激发单重 态(S1*)
内转换
振动弛豫 体系间跨越
S1*(V=0)
吸收
荧光
外转换 （熄灭）
第一电子 激发三重 态(T1*)
磷光
基态(S0)
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光 2、荧光的激发光谱和发射光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
1、分子荧光的产生（分子的电子能级与激发过程） 单重态(siglet state,S)：
总自旋量子数s=1/2+(-1/2)=0；多重性M=2s+1=1
三重态(triplet state,T)： 总自旋量子数s=1/2+1/2=1；多重性M=2s+1=3
激发单重态(S)
激发三重态(T)
基态(S0)
930型荧光计光路示意图 激发滤光片
发射滤光片
药物分析教研室
§3 荧光分光光度计和荧光分析新技术
§3.1 荧光分光光度计
荧光分光光度计结构示意图 1.光源
2、4、7、9.狭缝
3.激发单色器
5.样品池
6.表面吸光物质
8.发射单色器
10.检测器
11.放大器
12.指示器
13.记录器
药物分析教研室
§3 荧光分光光度计和荧光分析新技术
§1.1 分子荧光 3、荧光光谱的特征
➢斯托克斯位移(Stokes shift) ✓荧光发射波长总是大于激发光波长
➢荧光光谱的形状与激发波长无关
➢荧光光谱与激发光谱呈镜像关系
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光
4、荧光寿命和荧光效率
• 荧光寿命(fluorescence life time)：当除去激发光源后，分子
§1.2 荧光与分子结构
联苯f=0.2
芴f=1.0
-O
O
-O
O
O
COO 酚酞
COO -
荧光素钠药物分析教研室 Nhomakorabea§1 荧光分析法的基本原理
§1.2 荧光与分子结构
OH
N
8-羟基喹啉
SO3Na
CH 3 N
CH 3
O
N
Mg 1/2
8-羟基喹啉镁
NaO 3SH3C N CH3
1-二甲氨基萘-7-磺酸盐
f=0.75
• 物质分子发射荧光的两个必备条件
有强的紫外-可见吸收
荧光效率（f）要大
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.2 荧光与分子结构
有机化合物分子结构与荧光的关系
➢ 长共轭结构
共轭系统↑→ f ↑→ex、 em↑
➢ 分子的刚性和共平面性
共轭系统的刚性和共平面性↑→f↑
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§3.2 荧光分析新技术
➢激光荧光分析 ➢时间分辨荧光分析 (time-resolved fluorometry) ➢同步荧光分析 ➢胶束增敏荧光分析
药物分析教研室
思考题
▪名词解释：荧光与磷光、弛豫振动 ▪溶液荧光光谱有哪些特征？ ▪能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？ ▪为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？
1-二甲氨基萘-8-磺酸盐
f=0.03
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.2 荧光与分子结构
➢ 取代基
▪供电子基： –NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN
→f ↑，F↑
▪吸电子基： -NO2、-COOH、-NHCOCH3、 -C=O、-NO、-SH、-X
→ f ↓，F↓，甚至荧光熄灭 ▪-R、-SO3H、-NH3+→对f 无影响
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光
如：硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱 荧光光谱
激发光谱
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
• 荧光分析法(fluorometry)：是一种利用物质的荧光光谱特 性来进行分析的方法。
• 灵敏度：10-10~10-12g/ml
荧光
分子荧光(molecular fluorometry) 原子荧光(atomic fluorometry)
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
▪ 温度 ▪ 溶剂 ▪ pH值 ▪ 荧光熄灭剂 ▪ 散射光
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.3 影响荧光强度的外部因素
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
荧光光谱
激发 320nm
激发350nm
荧光448nm
§2.1 荧光强度与物质浓度的关系
荧光分析法与UV-vis定量测定时仪器校正的区别
UV-vis
0
100%
T=0，A=∞
T=100%，A=0
关闭光闸，光不透 空白溶液，光全透
过，全吸收
过，不吸收
荧光分析法
F=0 空白溶液，不发射
荧光
F=100% 对照品溶液Cmax
F=50%(Cmid)
药物分析教研室
的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间。用f表示。
• 荧光效率(fluorescence efficiemcy)：又称荧光量子产率
(fluorescence quantum yield)是指激发态分子发射荧光的光子数 与基态分子吸收激发光的光子数之比。f
• 荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要参数！
分析化学 Analytical Chemistry
药物分析教研室
药物分析教研室
概述
• 发光(phosphorescence)：物质受到一定波长的光照射后， 外层电子跃迁后返回基态时，以光辐射的形式释放能量，这 种现象称为发光。(荧光、磷光)
• 荧光(fluorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，从 激发态的最低振动能级返回基万言书时发射出的光。
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光
振动弛豫(vibrational relexation) 内部能量转换(internal conversion) 荧光(fluorescence)发射 外部能量转换(external conversion) 体系间跨越(intersystem crossing) 磷光发射
瑞利光320nm
拉曼光谱
拉曼光360nm
瑞利光350nm 拉曼光400nm
药物分析教研室
§2 荧光定量分析方法
§2.1 荧光强度与物质浓度的关系
荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光 干扰。
荧光定量分析的依据
当A=ECl≤0.05时
荧光强度：F=Kc
激发光源 垂直方向
药物分析教研室
§2 荧光定量分析方法
§3 荧光分光光度计和荧光分析新技术
§3.1 荧光分光光度计
荧光分析仪器的主要部件 ➢激发光源：汞灯、氙灯、氘灯、溴钨灯 ➢分光系统：滤光片；单色器（光栅） ➢样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光 ➢检测器：紫外-可见（光电倍增管）
药物分析教研室
§3 荧光分光光度计和荧光分析新技术
§3.1 荧光分光光度计
药物分析教研室
第二电子 激发单重 态(S2*)
第一电子 激发单重 态(S1*)
内转换
振动弛豫 体系间跨越
S1*(V=0)
吸收
荧光
外转换 （熄灭）
第一电子 激发三重 态(T1*)
磷光
基态(S0)
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光 2、荧光的激发光谱和发射光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
1、分子荧光的产生（分子的电子能级与激发过程） 单重态(siglet state,S)：
总自旋量子数s=1/2+(-1/2)=0；多重性M=2s+1=1
三重态(triplet state,T)： 总自旋量子数s=1/2+1/2=1；多重性M=2s+1=3
激发单重态(S)
激发三重态(T)
基态(S0)
930型荧光计光路示意图 激发滤光片
发射滤光片
药物分析教研室
§3 荧光分光光度计和荧光分析新技术
§3.1 荧光分光光度计
荧光分光光度计结构示意图 1.光源
2、4、7、9.狭缝
3.激发单色器
5.样品池
6.表面吸光物质
8.发射单色器
10.检测器
11.放大器
12.指示器
13.记录器
药物分析教研室
§3 荧光分光光度计和荧光分析新技术
§1.1 分子荧光 3、荧光光谱的特征
➢斯托克斯位移(Stokes shift) ✓荧光发射波长总是大于激发光波长
➢荧光光谱的形状与激发波长无关
➢荧光光谱与激发光谱呈镜像关系
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光
4、荧光寿命和荧光效率
• 荧光寿命(fluorescence life time)：当除去激发光源后，分子
§1.2 荧光与分子结构
联苯f=0.2
芴f=1.0
-O
O
-O
O
O
COO 酚酞
COO -
荧光素钠药物分析教研室 Nhomakorabea§1 荧光分析法的基本原理
§1.2 荧光与分子结构
OH
N
8-羟基喹啉
SO3Na
CH 3 N
CH 3
O
N
Mg 1/2
8-羟基喹啉镁
NaO 3SH3C N CH3
1-二甲氨基萘-7-磺酸盐
f=0.75
• 物质分子发射荧光的两个必备条件
有强的紫外-可见吸收
荧光效率（f）要大
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.2 荧光与分子结构
有机化合物分子结构与荧光的关系
➢ 长共轭结构
共轭系统↑→ f ↑→ex、 em↑
➢ 分子的刚性和共平面性
共轭系统的刚性和共平面性↑→f↑
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§3.2 荧光分析新技术
➢激光荧光分析 ➢时间分辨荧光分析 (time-resolved fluorometry) ➢同步荧光分析 ➢胶束增敏荧光分析
药物分析教研室
思考题
▪名词解释：荧光与磷光、弛豫振动 ▪溶液荧光光谱有哪些特征？ ▪能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？ ▪为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？
1-二甲氨基萘-8-磺酸盐
f=0.03
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.2 荧光与分子结构
➢ 取代基
▪供电子基： –NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN
→f ↑，F↑
▪吸电子基： -NO2、-COOH、-NHCOCH3、 -C=O、-NO、-SH、-X
→ f ↓，F↓，甚至荧光熄灭 ▪-R、-SO3H、-NH3+→对f 无影响
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光
如：硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱 荧光光谱
激发光谱
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
• 荧光分析法(fluorometry)：是一种利用物质的荧光光谱特 性来进行分析的方法。
• 灵敏度：10-10~10-12g/ml
荧光
分子荧光(molecular fluorometry) 原子荧光(atomic fluorometry)
药物分析教研室
§1 荧光分析法的基本原理
§1.1 分子荧光