小鼠大脑中动脉阻塞模型制备的经验总结

小鼠大脑中动脉阻塞模型制备的经验总结
缺血性脑血管疾病严重危害人类身体健康和生活质量，其发病预见性差、治疗时间窗短、复发率高，且往往会留下明显的后遗症。

脑缺血后经积极治疗脑血管可恢复再通，但也会导致重新获得血液供应的脑组织区域的损伤和机体功能障碍，即脑缺血再灌注损伤。

当前对于脑缺血再灌注损伤发病及治疗相关的神经学、病理生理学、药理学等研究日渐深入，而制备能精确模拟人脑缺血及缺血后再灌注的动物实验模型是上述实验研究的基础。

本文就目前国内外医学界普遍采用的线栓法小鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，结合作者多年的MCAO模型制备经验，作如下总结介绍。

1.实验前期准备：雄性小鼠（体重20-25g）、3.5%水合氯醛、碘伏、3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、冰冻切片包埋剂、小鼠脑切片模具、显微镊、显微剪、血管夹、手术缝合线、鱼线。

2.线栓的制备：在制备模型前，需首先制作适宜长度和内径的线栓，经过多次实验，笔者发现用直径0.15mm、长度15mm的鱼线制作线栓，阻塞小鼠大脑中动脉效果最好。

取固体石蜡一块，在瓷杯中加热熔化，将直径为鱼线的一端垂直浸润到熔化的石蜡中再迅速提起，石蜡凝固后可牢固地粘附在鱼线的一端，在鱼线15mm的位置处作一标记，线栓即制备完成。

3.MCAO模型的制备：小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛进行麻醉，麻醉后固定小鼠，碘伏消毒，颈部做切口。

从颈部切口中找到左侧颈总动脉（CCA），继续向上分离颈外动脉（ECA），结扎其各分支动脉血管，ECA残端结扎挂线，沿线轻轻提拉游离出ECA。

根据ECA位置在其斜下方找到颈内动脉（ICA），仔细分离并确定ICA的正确血管走向，之后用血管夹夹闭ICA远心端和CCA近心端，用细线结扎并在ECA起始端上打一活结。

在ECA靠近CCA部分剪小口，插入事先制备好的线栓，同时夹闭翼腭动脉（PPA），继续推进线栓。

待插入线栓约15mm时，会微遇阻力（此时小鼠出现略微挣扎现象），此时线栓头端正好插入MCA，将预先置于ECA起始端的细线扎紧，缝合颈部切口，碘伏消毒。

小鼠在
大脑中动脉阻塞2h后，再次用水合氯醛麻醉，剪开颈部缝合线，分离暴露ECA，拔出线栓，注意止血，结扎ECA残端，即可实现再灌注。

操作手法可如下图所示：
小鼠脑缺血再灌注24h后，颈椎脱臼处死，断头后于冰袋上取出完整的脑组织，去除嗅球、小脑和低位脑干，置于预冷的小鼠脑冠状切片磨具中，加入冰冻切片包埋剂，放入-20℃冰箱冷冻10-15min，切成1mm 厚片，共5片。

将脑切片均匀浸泡在2% TTC染液中，在37℃的避光环境中染色30 min，染色结果中红色区域为正常脑组织，白色部分为脑梗死区域。

将脑切片置于4%福尔马林中4℃下过夜固定。

次日将切片取出，排列，拍照，计算各组小鼠脑组织梗死面积，通过梗死面积计算梗死体积，梗死体积=梗死面积（mm2）×脑切片厚度（1mm）。

最终的脑梗死程度通过转换为梗死率来表示（脑梗死率=脑组织梗死体积/脑组织总体积×100%）。

4.神经功能缺陷评分
小鼠大脑中动脉阻塞2h，再灌注24h之后对小鼠进行神经功能缺陷评分。

评分标准为5分制，具体为：小鼠活动自如，无任何异常现象时，为0分；提起小鼠尾巴，小鼠会明显的向右侧扭转身体，右前肢快速异常抖动，伸直困难时，为1分；放下小鼠，让其自由活动，当其行走时会间断性或不停的向右侧旋转时，为2分；当小鼠自由活动时身体会明显的向其右侧方向侧重倾斜，且会间断性甚至持续向右侧跌倒时，为3分；当小鼠不能自己行走或小鼠出现昏迷时，为4分。

对于评分1-3分的小鼠，评价MCAO模型制备的成功性更可靠。

5. 脑梗死面积的观察
小鼠脑缺血再灌注24h后，颈椎脱臼处死，断头后于冰袋上取出完整的脑组织，去除嗅球、小脑和低位脑干，置于预冷的小鼠脑冠状切片磨具中，加入冰冻
切片包埋剂，放入-20℃冰箱冷冻10-15min，切成1mm 厚片。

将脑切片均匀浸泡在2% TTC染液中，在37℃的避光环境中染色30 min，染色结果中红色区域为正常脑组织，白色部分为脑梗死区域。

根据TTC染色，可更客观、准确的判断小鼠MCAO模型的制备是否成功。

6.实验注意事项：
（1）前期组织、肌肉的分离操作应按解剖顺序层层进行。

正中小鼠鼠颈部皮肤，分离皮下结缔组织时会发现该组织与颈部两侧鼓泡腺体结合紧密，此处分离不必太细。

对于其下的颈前肌群，可适当予以切断以暴露深部的颈总动脉以便于后续血管的分离，注意不能损伤附近的迷走神经，以免影响小鼠的正常呼吸导致死亡。

（2）分离血管时，可根据个人习惯选择从下到上或者从上到下的顺序，直至将整条ECA游离出来，注意在分类ECA过程中要将ECA的各分支完整结扎，以免小鼠失血过多。

分离出ECA后要根据CCA的走向选择平行于CCA的方向插入线栓，插入线栓之前要用血管夹夹闭ICA的两端。

在ECA剪切口时，切口大小要适中，既要防止切口过大造成ECA断裂（因为后续插线栓时需一直牵拉ECA），也要防止切口过小造成线栓不易插入。

（3）线栓经切口进入后颈内动脉后可逐渐插入，事先判断好ICA的方向有助于顺利插入，但因小鼠血管走向的个体差异以及血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄，经常会遇见线栓不易插入的情况。

此时切忌盲目向前用力插，以防止线栓弯曲变形更不易插入甚至线栓直接穿破血管，可以适时往外抽取部分线栓，灵活调整插入方向，反复多次尝试；也可更换线栓，重新调整方向，一般都可插入到MCAO中。

（4）整个手术时间以20-30 min为宜，要弃去手术时间过长及手术中失血过多的小鼠。

MCAO手术完成后，将小鼠小心移至温暖舒适的鼠笼中，一直保持适宜的温度，防止小鼠因体温过低而异常死亡。