寄生虫病原学诊断方法

➢流产胎儿，可取其第四胃内容物，胸水或腹水 检查。
➢检查时应将收集到的病料，立即放于载玻片上，并防 止材料干燥。对浓稠的阴道粘液，检查前最好以生理盐 水稀释2-3倍，羊水或包皮洗涤物最好先以每分钟2000 转的速度离心沉淀5分钟，而后以沉淀物制片检查。
未染色的标本主要检查活动的虫体，在显微镜下可见 其长度略大于一般的白细胞，能清楚地见到波动膜， 有时尚可见到鞭毛，在虫体内部可见含有一个圆形或 椭圆形的有强折光性的核。
1. 鲜血压滴标本检查 2. 涂片染色标本检查 3. 虫体浓集法
➢涂片法虽然可以查到血液中的原虫，但血液中的 虫体较少时，则不易查出虫体。为此常先进行集虫， 再制片检查。其操作过程是采病畜抗凝血6-7毫升， 以每分钟500转的速度离心5分钟，使其中大部分红 细胞沉降。
而后将含有少量红细胞，白细胞和虫体的上层血浆移 入另一离心管中，补加一些生理盐水，以每分钟2500 转的速度离心10分钟。取沉淀物制成抹片，按上述染 色法染色检查。此法适用于伊氏锥虫病和梨形虫病。
➢采取病料时，浮肿液和皮肤丘疹液用消毒的注射器 抽取，为了防止吸入血液发生凝固，可于注射器内 先吸入适量的 抗凝剂（2% 柠檬酸钠生理盐水）。
马阴道粘膜刮取物的采取，先用阴道扩张器扩张阴 道，再用长柄锐匙在其粘膜有炎症的部位刮取，刮 时应稍用力，使刮取物微带血液，则其中容易检到 锥虫。
采取公马尿道刮取物时，应先将马保定，左手伸入 包皮内，以食指插入龟头窝中，徐徐用力以牵出阴 茎，用消毒的长柄锐匙插入尿道内，刮取病料。
冲洗液应采用以玻璃蒸馏装置制备的蒸馏水配制生理 盐水，以保证冲洗液中不含金属离子，减少金属离子 对虫体的影响。病料采集后应尽快地进行检查。
➢由母畜采集病料，是取阴道分泌的透明粘液，以 直接自阴道内采取为良好，建议用一根长45厘米， 直径1.0厘米的玻璃管，在距一端的12厘米处，弯 成150°角，而后消毒备用。
生殖器官 切开并刮取粘膜，压片检查。怀疑为马媾疫
和牛胎儿毛滴虫病时，应涂片染色后油镜检查。
脑 先肉眼检查有无多头蚴，再切成薄片，压片检查
眼 结膜和结膜腔以括搔法处理检查。剖开眼球，将
前房水收集于皿中，在放大镜下检查。
心和主要血管 剖开将内容物洗于生理盐水中，反复用沉淀法检
查（对血管内分体吸虫的收集见后）。 膈脚
➢以上所采的病料，均可加适量的生理盐水，置载 玻片上，覆以盖玻片，制 成压滴标本检查；也可制 成抹片，用姬氏液染色后检查。
➢也可用灭菌纱布，以生理盐水浸湿，用敷料钳 夹持，插入公马尿道或母马阴道，擦洗后，取出 纱布，洗入无菌生理盐水中，将盐水离心沉淀， 取沉淀物检查，方法同上。
四、血液和组织内虫体检查法
其原理是锥虫和感染有梨形虫的红细胞较正常红细 胞的比重为轻，所以在第一次沉淀时，正常红细胞 下降，而锥虫和感染有梨形虫的红细胞尚悬浮在血 浆中。第二次离心沉淀时，则将其浓集于管底。
对于血液中的微丝蚴，也可用虫体浓集法。 方法是采血于离心管中。加入5%醋酸溶液以 溶血。待溶血完成后，离心并吸取沉淀检查。
吸取乳剂0.2毫升接种于小鼠腹腔，一般急性者在 4-5天后发病。病鼠被毛粗乱，食欲消失，腹部膨 大，有大量腹水，病程4-5天，最后死亡。抽取病 鼠或病死鼠的腹水作涂片，染色检查，可见大量 游离的滋养体。
六、动物剖检法
1.全身剖检法 ➢在动物死亡（或捕杀）后， 首先制作血片，染色检 查，观察血液中有无寄生虫，而后仔细检查体表，观察 有无体表寄生虫。 而后剥皮，观察皮下组织中有无虫体寄生。
➢镜检法为取膈肌肉样0.5~1g，剪成3×10mm的小块， 用厚玻片压紧，放显微镜下检查。
➢消化法为取100g肉样，搅碎或剪碎，放入3L的烧瓶 内。加入10g胃蛋白酶和2L自来水。然后加入16ml盐 酸（25%），放入1磁力搅拌棒。置于可加热的磁力搅 拌器上，设温于44~46℃。
30min后, 将消化液用180μm的滤筛滤入一2L的分离 漏斗, 静置30min, 放出40ml液体于一50ml的量筒内, 静置10min, 吸去30ml上清夜。 加入30ml水，摇匀。10min后，再吸去30ml上清液。 剩下的液体到入一带有格线的平皿内，用20-50倍显 微镜观察。
6. 粪便培养与幼虫分离法 ➢圆线虫目所属线虫种类很多，其虫卵在形态上非常 相似，很难区别。有时为了区别这些线虫的种类，常 将含有虫卵的粪便加以培养，待其中虫卵发育成为幼 虫时再检查，根据幼虫形态上的差异，加以鉴别。
➢最常用的方法是在培养皿底部加草纸或滤纸1张，而 后将欲培养的粪便加水调成硬糊状，塑成半球形，放 于皿内的纸上，并使半球形粪球的顶部略高出平皿边 沿，使加盖时与皿盖相接触。
于妊娠豚鼠的腹腔内，在接种后1-20天可以使妊娠 豚鼠发生流产，在其流产胎儿的消化道和胎盘里可 查出大量的毛滴虫。
4.弓形虫 弓形虫是多宿主病原原虫，多种家畜和实验动物均
具有易感性，但小鼠对之特别敏感，常常仅数十个虫 体即可使小鼠感染发病。
一般取急性死亡的可疑动物的肺、淋巴结、脾、肝或 脑组织，以1:5的比例加入生理盐水，制成乳剂，并加 少量青霉素和链霉素以控制细菌感染。
五、动物接种法
1. 伊氏锥虫 试验动物可用小鼠、大鼠、豚鼠、兔或 犬。其中尤以小鼠最适用。接种材料 用可疑病畜的抗凝血液，血液采取后 应在2-4小时内接种完毕。接种量0.51.0毫升，可接种于腹腔或皮下。
接种后的动物应隔离并经常检查。当病料中含虫较多时， 小鼠在接种后1-3日即可在其外周血液中查到锥虫，当病 料内含虫量少时，发病时间可能延长，因此接种后至少观 察一个月。也可于接种的第3天采接种小鼠的血液0.5~1.0 毫升，接种于另一只小鼠，如此盲传3代，即可在接种小 鼠外周血内发现虫体。
2.马媾疫 马媾疫锥虫不能接种百度文库多数实验动物，但可将
病畜的阴道或尿道刮取物与无菌生理盐水混合， 接种于公家兔的睾丸实质中，每个睾丸的接种量 为0.2毫升。
如有马媾疫锥虫存在，经1-2周后，即可见家兔 的阴囊、阴茎、睾丸以及耳、唇周围的皮肤发生 水肿，并可在水肿液内检出虫体。
3.胎儿毛滴虫 取病牛阴道分泌物或包皮冲洗液为病料，接种
将此皿置25℃温箱中，注意保持皿内湿度（应使底部 的垫纸保持潮湿状态）。经7天后，多数虫卵即可发 育成第三期幼虫，并集中于皿盖上的水滴中。将幼虫 吸出置载玻片上，放显微镜下检查。
➢有些寄生虫（如网尾科线虫），其虫卵在新排出的 粪便中已孵化为幼虫；类圆属线虫虫卵随粪便排出后， 在外界温度较高时，经5-12 h即孵出幼虫。为了提高 检出率，常将幼虫从粪便中分离出来进行检查。
➢将各内部脏器依次取出，先收集胸水，腹水，沉 淀后观察其中有无寄生虫。而后取出全部消化器官 及其所附的肝、胰等腺体。取出呼吸系统、泌尿系 统和生殖系统、心脏和大的动脉和静脉血管，分别 进行检查。
消化系统 先将附着其上的肝、胰取下，再将食道、胃
（反刍兽应将四个胃分开）、小肠、大肠、盲肠 分别结扎后分离。
使用时将管的“短臂”插入受检畜的阴道，另端接 一橡皮管并抽吸，少量阴道粘液即可吸入管内。取 出玻管，两端塞以棉球，带回实验室检查。
➢收集公牛包皮冲洗液，应先准备100-150毫升加 温到30-35℃的生理盐水，用针筒注入包皮腔。用 手指将包皮口捏紧，用另一手按摩包皮后部，而后 放松手指，将液体收集于广口瓶中待查。
第七章 寄生虫病诊断
第一节 病原学诊断方法
一、粪便虫卵检查法
1.直接涂片法 direct smear method
2.漂浮集卵法 flotation method
3.沉淀集卵法 sedimentation method
4.麦氏计数法 MacMaster method
5.毛蚴孵化法 ➢是诊断日本血吸虫及东毕吸虫的方法之一。
1 μm
二、体表虫体检查法
➢寄生于动物体表的寄生虫主要有蜱、螨、虱等。对 于它们的检查，可采用肉眼观察和显微镜观察相结 合的方法。
➢蜱寄生于动物体表，个体较大，通过肉眼观察即 可发现。 ➢螨和虱有些个体较小，常需刮取皮屑，于显微镜 下寻找虫体或卵。
三、生殖道虫体检查
➢寄生于生殖道的虫体主要有牛胎儿三毛滴虫 和马媾疫锥虫
4. 组织内虫体检查法 ➢有些原虫可以在动物身体的不同组织内寄生。一 般在死后剖检时，取一小块组织，以其切面在载玻 片上做成抹片、触片，或将小块组织固定后制成组 织切片，染色检查。抹片或触片可用瑞氏染色法或 姬氏染液染色。
➢泰勒虫感染的病畜常呈现局部体 表淋巴结肿大。取淋巴结穿刺物， 进行显微镜检查以寻找病原体，对 本病的早期诊断很有帮助。其方法 是，首先将病畜保定，用右手将肿 大的淋巴结稍向上方推移，并用左 手固定淋巴结。
特别是猪，应用镜检法和消化法进行检查。
2.个别器官和个别寄生虫剖检法
➢有时为了特定的目的，仅对某一器官或某一器官中 的某种寄生虫进行检查，如调查某一地某一器官中 寄生虫寄生的情况，或调查某一地区某种寄生虫的 流行情况，或考核某一药品对某种寄生虫的驱虫效 果。其剖检方法同全身剖检法。
➢牛胎儿毛滴虫存在于病母牛的阴道或子宫的分泌 物，流产胎儿的羊水、羊膜或其第四胃内容物中， 也存在于公牛的包皮鞘内，应采集以上各处的病料 寻找虫体。
➢由于虫体的检定常以见到运动活泼的虫体为准，故在 采集病料时必须尽可能地避免污染，以免其它鞭毛虫混 入病料造成误诊。采集用的器皿和冲洗液等应加热使接 近体温，否则虫体骤然遇冷会失去活动力或死亡。
➢常用的方法为 漏斗幼虫分离法 亦称贝尔曼法 (Baermann's technique)
7. 测微技术 ➢各种虫卵和幼虫，大小通常较为恒定。虫卵或幼虫的 大小可作为确定某一虫卵或幼虫的依据。虫卵和幼虫 的测量需用测微器。
长1mm的直 线等分为100 小格,每小格 等于10 μm
10倍物镜，标定后 每小格是多少？
呼吸器官 用剪刀将鼻、喉、气管、支气管切开，寻找
虫体。用小刀刮气管粘膜，刮下物在解剖镜下检 查。肺组织按肝脏处理方法。
泌尿器官 切开肾，先对肾盂作肉眼检查，再刮取肾盂粘膜
检查。最后将肾实质切成薄片，压于两玻片间，在放 大镜或解剖镜下检查。剪开输尿管，膀胱和尿道，检 查其粘膜，并注意粘膜下有无包囊。收集尿液，用反 复沉淀法处理。
穿刺时先局部消毒，将皮肤推向一侧， 针头以略倾斜的方向向下刺入，深度约 2-4厘米，针头刺入腹腔后会感到阻力骤 减，而后有腹水流出。取得的腹水可在 载玻片上抹片，以瑞氏液或姬氏液染色 后检查。
➢肌肉中旋毛虫的检查，是肉品卫生检验的重要项目， 世界各国使用的方法大同小异。传统的方法为镜检 法，但目前多用消化法。
局部剪毛，消毒，以10毫升注射器和较粗的针头刺 入淋巴结，抽取淋巴组织；拔出针头，将针头内容 物推挤到载玻片上，涂成抹片，固定，染色，镜检， 可以找到柯赫氏蓝体。
➢家畜患弓形虫病时，除死后可在一些组织中找到 包囊和速殖子外，生前诊断可取腹水，检查其中滋 养体的存在。收集腹水，猪只可采取侧卧保定，穿 刺部在白线下侧脐的后方（公畜）或前方（母畜） 1-2厘米处。
波动膜常作为本虫与其它一些非致病性鞭毛虫和 纤毛虫在形态上相区别的依据。也可将标本固定， 用姬氏染液或苏木素染色后检查。
➢马媾疫锥虫在末梢血液中很少出现，因 此血液学检查在马媾疫诊断上的用处不大。 检查材料主要应采取浮肿部皮肤或丘疹的 抽出液，尿道及阴道的粘膜刮取物，特别 在粘膜刮取物中最易发现虫体。