DNA提取纯化

提取噬菌体DNA
– 噬菌体的培养、收集、纯化 – 纯化M13 DNA
1.制备总DNA
基本步骤： 1) 培养、收集细菌 细胞 2)打碎细胞，释 放内容物 3)去掉DNA以外 的成分 4)DNA溶液的浓缩
1.1培养、搜集细菌细胞
两种类型的细菌培养基的成分： M9培养基(确定成分培养基)：g/L Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) 葡萄糖(2.0) CaCl2(0.015) LB培养基(不确定成分培养基) ：g/L typtone(10) 提供氨基酸以及肽段 Yeast extract(5) 提供氮源、糖类、有机和无机营养 NaCl(10)
3 噬菌体DNA的制备
3.3 从λ噬菌体中纯化DNA
PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂 解物，也可能含有细菌DNA。这些组 成部分可以通过梯度离心去掉。除去 CsCl后可以获得纯净的λ噬菌体。然 后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质 外壳。
Purification
of λ phage
Purification of λ phage particles by CsCl density gradient centrifugation.
1.3 DNA的纯化
去掉DNA以外的成分 蛋白酶K/苯酚——蛋白质 RNA酶——RNA
◆ Purification of DNA from a cell extract
Removal of protein contaminants by phenol extraction.
1.4 DNA的浓缩以及浓度、纯度的测定
Lysogenic λ phage
At 30 ℃, cl gene protein works, Keep lysogeny: At 42 ℃, cl gene protein does not work, produce extracellular phage.
Induction of a λ cl
2.2 根据分子构造提取
EB—CsCl密度梯度离心法 在较大的离心力条件下，CsCl形成梯
度，生物大分子形成不同的条带，条 带的位置取决于其浮力密度。 最上部是蛋白质，中间是DNA，下部 是RNA。
CsCl density gradient centrifugation
CsCl density gradient centrifugation.
溴化乙锭 Ethidium bromide, EtBr, EB
EB与DNA结合的多少与DNA分子的大小及其分子的 数目成正比，因此荧光强度的大小可所反映DNA片段 的大小及其数量。
DNA浓度的测定
琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖(Agarose)是从海藻中提取的 一种线状多糖高聚体。
琼脂糖凝胶电泳的制备和检查
Chapter 3 DNA的提取与纯化
基因工程需要三种不同的DNA: 全细胞DNA(总DNA, total cell DNA) 质粒DNA 噬菌体DNA
学习内容：
制备细胞总DNA
– 培养、搜集细菌细胞 – 制备细胞提取物 – DNA纯化、浓缩
质粒DNA提取
– 根据分子大小分离 – 根据结构分离 – 质粒扩增
EB
EB如何与DNA结合?
Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercalation between adjacent base parirs.
2.2 EB—CsCl密度梯度离心法
EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮 力密度，线形DNA大约会降低0.125g/cm3； 但超螺旋的DNA结合EB少，浮力密度降低 较小，仅降低0.085g/cm3。
DNA的浓缩
最常用的浓缩方法 是乙醇沉淀（同时 含有Na离子的条 件下）。DNA沉 淀可用玻璃棒挑出， 或者离心沉淀（杂 质）。
1.4 DNA的浓缩与浓度、纯度的测定
DNA浓度的测定
260nm下测定吸光度，1OD相当于 50μg双链DNA/ml（ 40μg单链DNA或 RNA/ml ）。
电泳检测
核酸具有结合染料的能力
3 噬菌体DNA的制备
3.1 噬菌体的培养
自然培养的λ噬菌体是溶源性 的。要获得大量的细胞外λ噬菌体， 必须经过诱导培养使所有的λ噬菌 体都进入裂解周期，使细胞死亡释 放λ噬菌体。
3.1 噬菌体的培养
大部分实验室都使用cI突变的温度敏 感突变体。cI基因可以使噬菌体保持 整合状态，突变后转变成溶菌性的。 在cI突变体中，cI基因在30°C条件下 正常表达，在42°C时，不能正常表 达，产生溶菌性。
问题： – 裂解液中不可避免的包含一些染色 体DNA。 – 质粒分子非常大时 ，将与细胞残留 物共沉淀。
2.2 根据分子构造提取
碱裂解法 在非常窄的pH范围内，非超螺旋化的DNA 会变性，而超螺旋化的质粒DNA不变性。 在裂解液中加入氢氧化钠，调pH值至 12.0~12.5，破坏氢键，使非超螺旋化的 DNA变性。加入酸，变性的细菌DNA进一 步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。 同时利用SDS裂解，KAc中和可以去掉大部 分的蛋白质和RNA。上清液中只剩下超螺 旋化的质粒DNA了。
– 溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分 泌物中，能消化细胞壁的多聚物。
– EDTA络合保持细胞结构完整的钙离子， 也可以抑制DNA酶的活性。 – 提取液中同时还加入SDS，使细胞膜破 裂，协助细胞壁的溶解。
Preparation of a cell extract
Preparation of a cell extract.
3 噬菌体DNA的制备
3.2 噬菌体的收集
噬菌体颗粒非常小，所以只有高 速离心才能沉淀。通常利用PEG沉 淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可 以收集λ噬菌体，重新溶解在少量 的溶液中。
Collection of phage particles
Collection of phage particles by polyethylene glycol(PEG) precipitation
EB可以用丁醇抽提。
CsCl可以用透析除去，纯度可达100%。
如何分离质 粒DNA？
Purification of plasmiod DNA by EtBr-CsCl density gradient centrifugation
2质粒DNA提取
2.3 质粒扩增 一些多拷贝质粒具有在无蛋白合 成条件下复制的能力。当细胞增加到 足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如 氯霉素，继续培养。在这个过程中， 质粒分子继续复制，但染色体的复制 和细胞分裂已经停止，可以获得上千 个拷贝。
配制缓冲液等 配制琼脂糖凝胶 TAE
TBE
TPE
装备电泳装置
核酸上样 核酸迁移 观察
琼脂糖凝胶电泳的制备和检查
溴酚兰作用？
琼脂糖凝胶电泳的制备和检查 P102
电泳检测
1.4 DNA的浓缩与浓度、纯度的测 定
DNA纯度的测定
A260/A280=1.8，<1.8 表示含有 酚或蛋白质， > 1.8说明有RNA。
DNA的纯化—离子 交换层析法 P101
The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purificat(十六烷基三甲基溴化铵)
去污剂， CTAB在低盐浓度下与核酸结合， 在 高盐浓度下又与核酸分离。适用于糖、 脂含量较高的植物。
● Plasmid amplification Inhibitor of protein synthesis: Chloramphenical, 12h,
Plasmid amplification
3 噬菌体DNA的制备
当培养物离心时，细菌沉淀到底 部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白 就可以获得噬菌体DNA。 然而获得大量的噬菌体DNA是一 个障碍。每ml菌液可以获得1010λ噬 菌体，但只能产生500ngDNA。
2质粒DNA提取
2.1 根据分子大小提取质粒DNA
在蔗糖存在时用EDTA和溶菌酶处理，可以 破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整； 用非离子去垢剂如Triton X-100处理，诱导 细胞裂解； 离心分离，小分子质粒位于裂解液上清； 而细菌大分子DNA则沉淀下来。
2.1 根据分子大小提取质粒DNA
Alkaline denaturation
Plasmid purification by the alkaline denaturation method.
DNA分子的构象 P102
I 型：超螺旋环状 II 型：带切口环
Circular forms of DNA migrate in agarose distinctly differently from linear DNAs of the same mass. Typically uncut plasmids will appear to migrate more rapidly than the same plasmid when linearized. Additionally, most preparations of uncut plasmid contain at least two topologicallydifferent forms of DNA, corresponding to supercoiled forms and nicked circles. The image to the right shows an ethidium-stained gel with uncut plasmid in the left lane and the same plasmid linearized at a single site in the right lane.
3.4 纯化M13 DNA
每ml菌液可以获得1012的噬菌体。这 意味着少量的培养物可以获得大量的 噬菌体。
由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解 物的问题，也不需要CsCl梯度离心。
Preparation
of M13 DNA
Preparation of M13 DNA from an infected culture of bacteria.
1.1培养、收集细菌细胞
37°C，150250rpm培养10小 时左右。 达到最大浓度23×109cell/ml。 600nm下的OD值， 1OD相当于 0.8×109cell/ml 。
Harvesting bacteria by centrifugation
1.2 制备细胞提取物
利用溶菌酶、EDTA或两者结合。
lysogen by transferring from 30 ℃ to 42℃
Non-lysogenic
λ phage（Lytic)
由于缺失修饰，大 多数基因工程载体 属于此类型。
Achieving the right balance between culture age and inoculum size when preparing a sample of a non-lysogenic phage
SDS法(十二烷基磺酸钠)
去污剂，使细胞膜破裂，协助细胞壁的溶 解
CTAB法提取植物DNA
2 质粒DNA提取
根据质粒DNA的大小（质粒分子最大
不超过大肠杆菌染色体的 8%）
根据DNA的构造
◇碱裂解法 Alkaline denaturation ◇ EB—CsCl密度梯度离心法 Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation