Molecular Devices SpectraMax Paradigm多功能读扳机进行HTRF人肿瘤坏死因子实验

SpectraMax Paradigm多功能读扳机进行HTRF人肿瘤坏死因子实验

材料

Figure 1. Human TNFα assay principle

Human TNF

α

Cryptate conjugate

Antibodies labeled with donor and acceptor fluorophores bind to TNFα, bringing the labels into close proximity and enabling TR-FRET.

• 人肿瘤坏死因子检测试剂盒，1000 test (Cisbio P/N 62TNFPEB)

• 黑色和白色低体积384孔微孔板

(Greiner P/N 784076 and 784075)• SpectraMax Paradigm多功能酶标仪 (Molecular Devices)

• HTRF检测试剂盒

(Molecular Devices P/N 0200-7011)

本应用记录了我们如何使用SpectraMax Paradigm多功能读扳机执行稳定，免洗细胞因子实验，并具有良好的Z因子。

HTRF是由Cisbio试剂公司研发的多功能技术，用于检测生物分子间相互作用。它结合了荧光共振能量转移(FRET)技术和时间分辨荧光(TRF)技术，实现消除半衰期短的背景荧光。这个实验应用供体和受体荧光染料。当供体和受体之间足够近的情况下，由光源(如，高能闪烁氙灯)照射产生的供体激发光就会通过能量转移机制到受体，反过来作为受体的特定激发波长。HTRF采用四个特定的荧光染料，可以组合成兼容的供体-受体TR-FRET对。供体为铕元素(Eu3+)和铽元素(lumi4™- Tb)，其长寿命荧光使它们可以应用在时间分辨荧光实验中。两种受体已经被研发用于HTRF实验，分别是, XL665 and d2。都具有激发光谱重叠的HTRF供体的发射光谱。每个都在665nm有一个发射峰，但这个区域的波长并不能激发供体，或者激发非常弱。最早期的的HTRF受体，XL665，来源于红藻的藻胆蛋白色素的纯化。第二代受体，d2，是一种改进的别藻蓝蛋白，比X L 665小100倍，用来缓解可能发生在XL665检测时的空间位阻问题。

类似于肿瘤坏死因子(TNFα)的细胞因子在肿瘤、感染性疾病、过敏和自身免疫性疾病等领域都有特别的兴趣。细胞因子的调节紊乱会引起不适当或无效的免疫反应。人肿瘤坏死因子检测试剂盒能够直接进行TNFα的定量。涉及两个特异性抗体的三明治免疫试验，一个抗TNFα偶联Eu元素，第二个抗TNFα标记XL665 or d2。TNFα存在的情况下，两个抗体都会结合TNFα，当两个标记足够近的情况下就会发生TR-FRET(见图1)。信号与样品中抗原的浓度成正比。

Table 1. Assay setup for a 384-well low-volume plate

方法

Table 2. Optimized instrument settings for SpectraMax Paradigm reader with HTRF Detection Cartridge

1. Ratio =

x 104

Emission 665nm

Emission 616nm

2. Mean Ratio =∑ratios 2

3. CV =

x 100

Std deviation

Mean ratio

4. Delta F =

x 100

Standard or sample Ratio –Ratio neg

Ratio neg

(Ratio neg = Ratio of negative control)

Figure 2. HTRF Human TNF α calibration curve

TNF-alpha (pg/mL)

D e l t a F %

人肿瘤坏死因子标准品浓度范围从20到2000 pg/ml，制备方法如试剂盒内的产品说明书所示。内含人肿瘤坏死因子的阳性质控和没有人肿瘤坏死因子的阴性质控(没有TR-FRET)，包括确认检测活性并有助于准确的计算结果。试剂最后每孔的体积为20ul，如表1所示。

数据分析

HTRF试剂的分析方法采用Cisbio公司的专利比例还原法，是基于两种激发波长检测。供体在616nm的发射作为内参，而在665nm的受体的发射被用来作为一个生物反应的指标被检测。这种比例检测方法减少了孔间干扰并消除了复合物的干扰。在下面第四步计算的Delta F值，反映了信号的实验背景，对内部试剂间比较很有用。

结果通过665nm/616nm比值进行计算并用Delta F值表示：

Z ’ factor值由阴性对照和2000pg/ml 的标准品计算得到。数据获取和分析都是由SoftMax ® Pro完成，软件内置多种优化好的HTRF模板来简化检测和分析。

微孔板贴膜室温孵育三小时，然后在SpectraMax Paradigm酶标仪的HTRF卡盒上检测

时间分辨荧光（仪器设置见表二）

HTRF Human TNFα 计算曲线由 SpectraMax Paradigm酶标仪产生. 蓝色：黑板；红色：白板。R2值都为1.00.

Compatible with these Molecular Devices systems

SpectraMax i3 Multi-Mode

Microplate Reader SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader SpectraMax M5e Multi-Mode

Microplate Reader

结果

SpectraMax Paradigm酶标仪具有读板高度和板的优化功能，让用户可以轻松确定最佳的阅读高度和板尺寸，提高检测的动态范围和灵敏度。两种优化都是针对一个Greiner板进行。数据表示为Delta F %(DF %)和TNFα浓度作图(图2)。每次检测采用30个脉冲以得到最好的结果，延迟0.03毫秒和检测时间为0.2毫秒(表2)使用低体积的白色和黑色的384孔板可以得到相似的结果。黑板DF %值的范围从21到927和白盘的从7到810。虽然用黑板检测的窗口大，但是Z’factor白板为0.95，而黑板是0.86，白板会显示更好的整体检测性能。

结论

SpectraMax Paradigm酶标仪配置HTRF检测卡盒实现高通量筛选的同时，保证优化的读板时间和Z ’ factor值。双通道发射同时检测也使得384孔板全板的读板时间只有2/17。在SpectraMax Paradigm酶标仪上获得的高Z’factor显示出好的灵明度和动态范围。这种方法也可以在SpectraMax ®i3和SpectraMax ® M5e多功能酶标仪上检测。数据采集和分析

可以通过SoftMax Pro软件预设的HTRF模板进行简化。

文献

1. /htrf-technology

2. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., and Oldenburg, K. R. (1999). A simple statistical parameter for use in evalu-ation and validation of high through-put screening assays.J.Biomolecular Screening 4(2): 67-7

3.

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