雌激素对心肌梗死大鼠外周血干细胞及血管生成的影响

雌激素对心肌梗死大鼠外周血干细胞及血管生成的
影响1
金鑫，陈玉成△，曾智，刘伟强，王斌，王浩宇
四川大学华西医院心内科，成都（610041)
E-mail：chenyucheng2003@
摘要：目的探讨雌激素对急性心肌梗死大鼠外周血干细胞和心肌血管生成的影响。

方法结扎去卵巢Sprague-Dauley(SD)大鼠左冠状动脉制作急性心肌梗死模型，给予不同剂量苯甲酸雌二醇干预治疗，分别于急性心梗24h后免疫组化法检测归巢心肌的CD34+细胞数量，于1、3、7d流式细胞术测定外周血CD34+细胞数，同时于心梗后1、3、7d免疫组化法测定心肌中基质细胞衍生因子（SDF-1）的表达，分析心梗4W后心肌组织中微血管密度判断血管新生情况。

结果与卵巢完整大鼠相比，去卵巢大鼠心梗后外周血和心肌组织中CD34+细胞数、SDF-1的表达和4W后毛细血管密度显著降低，雌激素干预各组上述指标明显升高，其中，雌激素替代组最高。

结论去卵巢大鼠心肌梗死前应用雌激素替代治疗，可增加心梗后骨髓干细胞的动员和归巢, 促进心肌毛细血管生成，这一作用可能于雌激素促进心肌SDF-1表达有关。

关键词：心肌血管生成，骨髓干细胞，动员，归巢，雌激素
大量的基础和临床实验均已证实，雌激素具有强大的心血管保护作用，如降低血清脂蛋白[1]，调节凝血纤溶系统[2]，增加内皮一氧化氮和一氧化氮合酶的合成[3]，提高组织的抗氧化能力[4]等。

同时也有报道[5]，雌激素对受损心肌细胞和血管内皮细胞具有强大的修复作用，并促进心肌梗死后心功能的改善，间接调节导致心力衰竭和心室重构的内分泌因素如肾素－血管紧张素－醛固酮系统、心钠素、内皮素、前列腺素、基质金属蛋白酶等的表达，改善预后。

最近，Iwakura等人[6,7]先后报道雌激素在动脉损伤后促进骨髓干细胞动员，使损伤血管再内皮化。

但是，对于心肌梗塞发生后，雌激素对于外周血干细胞是否也有动员作用以及其机制目前尚无相应研究。

我们推测，雌激素可能对骨髓干细胞的动员与归巢发挥作用并参与了心梗后心肌血管生成，这样的作用可能同雌激素改善心梗的预后有关。

本研究通过观察不同雌激素水平下急性心肌梗死大鼠外周血CD34+细胞的动员和心肌归巢，探讨这一作用对心梗后血管生成的意义，并进一步探讨这一作用机制，为进一步认识雌激素在心血管系统中的药理作用提供一定的实验依据。

1. 材料和方法
1. 1 实验动物和材料
正常成年雌性Sprague-Dauley(SD)大鼠50只（四川大学华西动物实验中心），体重约180±20g；兔抗大鼠CD34+多克隆抗体、兔抗大鼠SDF-1多克隆抗体、Ⅷ因子相关抗原抗体和SABC试剂盒（武汉博士德公司）；流式细胞仪（美国Coulter公司，epics Elite ESP）。

1. 2 实验方法
1.2.1 实验分组
取雌性大鼠50只，随机分为5组，每组各10只。

急性心肌梗死组（acute myocardial infarction，AMI）；去卵巢后急性心肌梗死组（ovariectomized myocardial infarction，OMI）：
1本课题受教育部博士点基金“心肌内注射雌激素血管生成效应及相关机制研究”（20040610057）资助
去卵巢后两周实施左冠状动脉结扎术；去卵巢后心梗＋雌激素治疗生理剂量组（estrogen physiological dose therapy，EPT）：去卵巢后两周实施左冠状动脉结扎术，给予苯甲酸雌二醇注射液0.1mg/kg肌注，隔天一次；去卵巢后心梗＋雌激素治疗大剂量组（estrogen high dose therapy，EHT）：去卵巢后两周实施左冠状动脉结扎术，给予苯甲酸雌二醇注射液1mg/kg 肌注，隔天一次；去卵巢后雌激素替代＋心梗组（estrogen replacement therapy，ERT）：去卵巢后给予苯甲酸雌二醇注射液1mg/kg肌注，隔天一次，两周后实施冠状动脉结扎术。

1.2.2 动物模型的建立
去卵巢术：用质量分数10％水合氯醛（3ml/kg体重）腹腔麻醉，消毒皮肤做下腹部正中切口，结扎切除双侧卵巢后逐层缝合。

心肌梗死模型建立：将大鼠用质量分数10％水合氯醛（3ml/kg体重）作腹腔麻醉,气管插管,人工通气，四肢皮下置针型电极,记录心电变化。

在心脏搏动最明显处分层开胸,用“0/6”缝线在左心耳根部下2mm处结扎左前降支,形成急性心肌梗死模型。

剔除心电记录无ST 段弓背往上抬高和(或) 异常Q 波的大鼠，术后连续肌注青霉素3d，预防感染，继续喂养至术后四周。

1.2.3 外周血CD34+细胞的检测
分别于心梗后第1、3、7天经眼底静脉丛采血0.1ml，肝素抗凝，取50µL全血加入5µL CD34+多克隆抗体，充分混匀后静置30min，加入溶血剂充分裂解红细胞，4℃PBS洗涤两次，加入FITC标记的羊抗兔IgG，并设阴性对照，流式细
胞仪检测外周血中CD34+细胞占单个核细胞的百分率。

1.2.4 心肌组织中CD34+、SDF-1的表达检测
取心脏4％多聚甲醛固定24小时，常规石蜡包埋及梗死部位组织切片，片厚4µm。

石蜡切片进行免疫组织化学染色，分别加CD34+(1:50)、SDF-1(1:100)抗体4℃冰箱中过夜，二抗(1：200,北京中杉公司)室温孵育1h，DAB显色后脱水透明,中性树胶封片。

阴性对照片不加一抗，以正常羊血清替代，余步骤相同。

日本Olympus显微镜下观察并照像。

1.2.5 心肌毛细血管密度测定
于心梗后4周处死各组大鼠，取出心脏4％多聚甲醛固定24小时，常规石蜡包埋及梗死部位组织切片，行Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色。

口径小于25µm的血管被判定为毛细血管，与邻近的微血管、炎性组织或心肌细胞明显区分的任何棕染的内皮细胞或内皮细胞丛都被判定为一个可计算的微血管。

可见的血管腔并不是计数微血管必需的结构。

用日本Olympus公司光学显微镜计数每400倍视野中微血管的数目，以6个高倍视野微血管数的均数计数。

1. 3 结果判定及统计学分析
免疫组化结果判定采用双盲法。

每例动物随机选取5张切片,对每一切片随机选取8个高倍视野记数，取其平均值作为测定值。

统计学处理采用SPSS11.5分析系统，定量资料两组间比较采用t检验，多组均数比较使用单向方差分析（One-Way ANOV A）。

P<0.05为差异有显著意义。

2. 结果
2. 1 心梗后外周血CD34+细胞的变化
心肌梗死后第1d ，OMI 组外周血CD34+细胞占单个核细胞的百分比最低，AMI 组与EPT 组无显著性差异（P.>0.05），但均低于EHT 组和ERT 组(P<0.05)。

心梗后第3d 各组外周血CD34+细胞数较第1d 增高(P<0.05)，其中，ERT 组最高，EHT 组次之，AMI 组和EPT 组仍未见统计学差异（P>0.05）。

第7d 各组外周血CD34+细胞数较第3d 进一步升高，且各实验组均有显著性差异(P<0.05，图1)。

0.05
0.10.150.20.25AMI
OMI
EPT
EHT
ERT
Groups
T h e p e r c e n t a g e o f
p e r i p h e r a l b l o o d C D 34+c e l l s (%)
图1 各实验组心梗后1、3、7d 外周血CD34+细胞流式细胞术分析
2. 2 心肌组织中CD34+的表达
心梗后24h 各组大鼠心肌组织中均可见CD34+细胞浸润，其阳性信号存在于胞浆，镜下呈棕黄色，主要集中在心梗区和心梗边缘区，其中以边缘区阳性细胞聚集最多，正常心肌组织中未见CD34+细胞的出现。

ERT 组阳性细胞数明显高于其余各组（P<0.01，图2）
51015202530AMI
OMI
EPT
EHT
ERT
Groups
C D 34+ c e l l s i n
m y o c a r d i u m (×400 f o l d )
图2 各实验组心梗后24h 心肌组织中CD34+细胞数
2. 3 心肌组织中SDF-1的表达
以心肌细胞胞浆内或细胞外基质出现棕黄色颗粒为阳性判定标准，制模后24h ，各组大鼠心肌组织中仅梗死区内可见SDF-1的表达，边缘区及正常心肌组织中未见表达。

3d 后各组大鼠心肌梗死区和边缘区均可见SDF-1阳性表达，正常心肌中未见。

心肌梗死后第1、3、7d 各实验组SDF-1表达逐渐增加(P<0.05)。

心梗后第1d ，AMI 组与EPT 组、EHT 组比较无差异(P>0.05)，OMI 组表达降低，ERT 组较AMI 组表达升高。

第3d EHT 组和ERT 组SDF-1
表达较AMI 组高，OMI 组表达最低(P<0.05)。

第7d 各组间比较均有显著性差异，ERT 组阳性表达仍为最高(P<0.05)。

其平均光密度值变化见图3。

图3 各实验组心梗后1、3、7d 心肌组织中SDF-1的表达
2. 4 梗死边缘区毛细血管密度的测定
4周后各组大鼠心肌组织中均可见新生的毛细血管，以梗死边缘区密度最高，ERT 组毛细血管密度明显高于其余各组(P<0.05)，OMI 组最低。

见图4。

102030AMI
OMI
EPT
EHT
ERT
Groups
C a p i l l a r y d e n s i t y (×400f o l d )
图4 各实验组心梗后4w 新生毛细血管数
3. 讨论
雌激素的促血管生成效应最典型表现为女性月经周期中子宫内膜的血管生长，进一步的研究发现雌激素促进肿瘤的血管生成并同乳腺癌、子宫内膜癌的侵袭性相关，另外一些与血管内皮细胞增殖相关的疾病如Takayasu ,s 关节炎、系统性红斑狼疮多见于绝经前女性，也提示雌激素可能在内皮细胞增殖、血管生成方面具有重要调节作用。

有研究表明[8、9]
，雌激素
能增加缺血大脑和肢体微血管密度和再灌注，刺激血管内皮细胞增殖和迁移[10]，抗血管内
皮细胞凋亡，这些研究表明雌激素可能在治疗动脉缺血疾病中发挥新的作用。

本实验证实了雌激素在大鼠心肌梗死后能促进心肌新生血管的生成，我们发现在不同雌激素水平作用下，其新生毛细血管数量不同，同卵巢完整大鼠发生心梗后相比，去卵巢组大鼠心梗后血管生成数显著减少，雌激素替代治疗后大鼠心梗后血管生成数增多，这验证了雌激素在心梗后心肌血管再生，侧支循环建立中起着重要的调节作用，也可以解释绝经前女性发生心肌梗死往往较绝经后妇女预后良好。

同时我们对大鼠心梗后外周血进行流式细胞术分
析发现，心肌梗死后第1、3、7d各实验组外周血CD34+细胞数逐渐增加，且在不同雌激素水平下大鼠心肌梗死后外周血CD34+细胞占单个核细胞的比例是有差异的，雌激素替代组外周血CD34+细胞比例在各时间点都最高，切除卵巢组最低。

事实上，心肌梗死后机体本身存在着干细胞动员反应，Shintani等[11]发现急性心肌梗死患者外周血干细胞和内皮前体细胞在心梗后第7d明显升高。

我们的实验结果也显示卵巢完整大鼠心梗后外周血CD34+细胞随时间逐渐增多，雌激素干预后外周血CD34+细胞较保留卵巢大鼠进一步增多，这种差异理论上支持雌激素可促进心肌梗死后大鼠外周血CD34+细胞的动员。

我们在心梗后24h对梗死心肌行免疫组化染色，观察到CD34+细胞表达于心肌梗死灶的周围，且随着雌激素水平的增高阳性细胞数目增多。

由此我们推断，雌激素促心梗后心肌血管生成效应可能部分来源于骨髓干细胞的动员和归巢，扩大其对损伤组织的修复。

骨髓干细胞促进血管再生的机制可能为：动员至心肌梗死区CD34+骨髓干细胞在心肌缺血微环境作用下，以自分泌或旁分泌的方式分泌炎性细胞因子、血管生长因子等多种细胞因子，在各种细胞因子的作用下内皮祖细胞定向分化为血管内皮细胞，参与血管的形成，使缺血心肌组织再血管化，使梗死边缘心肌得到灌注。

Seiler 等[12]对21例严重不稳定型心绞痛老龄患者采取随机对照双盲试验，动员组10例患者注射GM-CSF，对照组11例给予安慰剂，2周后动员组患者心脏侧支循环较治疗前显著改善，心电图缺血表现也较前减少，说明可以通过干细胞动员促进血管再生改善冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的侧支循环，以达到治疗作用。

本实验中我们还发现心梗边缘区及瘢痕区均可见新生毛细血管存在，以边缘区更多见，推测其可能的原因是外周血中干细胞通过血循环到达心梗区，边缘区心肌中存在血管数目较多，而梗死区一部分血管也发生了坏死，因此干细胞由血管浸润到心梗区边缘的数量要多于梗死区内部。

基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor,SDF-1）是第一个报道的CD34+造血祖细胞的趋化因子，可以诱导骨髓CD34+的造血干细胞定向迁移[13]，且骨髓干细胞的迁移有赖于SDF-1的浓度梯度[14],当SDF-1浓度梯度消失时，SDF-1趋化作用消失。

本实验我们观察到SDF-1在心梗后心肌组织中表达上调，仅于心肌梗死的急性期，同时在心肌梗死灶周边也见CD34+细胞的浸润，说明在心梗的急性期，心肌组织在缺血状态分泌SDF-1增加，促进骨髓干细胞向心肌梗死区归巢，参与受损心肌细胞和血管内皮细胞的修复[15]，但量较少可能不足以逆转骨髓中的SDF-1浓度梯度使大量骨髓干细胞向心肌梗死区迁移参与局部修复。

在雌激素的作用下，可提高心肌梗死组织周围SDF-1的表达，扩大其与骨髓SDF-1浓度差，动员更多的CD34+细胞进入到外周血循环，按浓度梯度定向迁移至心梗区，进行损伤的修复。

本实验研究证实雌激素能促进缺血心肌毛细血管生成，其机制可能为促进骨髓干细胞动员、迁移和归巢至缺血损伤的心肌组织内，促进梗死心肌组织中血管内皮细胞的增殖，促进血管再生，对缺血心肌进行直接或间接的修复。

这说明了雌激素在促心肌血管生成治疗上具有良好的应用前景。

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Effects of estradiol intervention on peripheral blood stem cells and angiogenesis in myocardial infarction rats Jin Xin，Chen Yucheng，Zeng Zhi，Liu Weiqiang，Wang bin，Wang Haoyu Dept of cardiology of the west china hospital，sichuan university，Chengdu （610041）
E-mail：chenyucheng2003@
Abstract
Aim To study the influence of estradiol on peripheral blood stem cells and angiogenesis in a rat model of myocardial infarction. Methods Acute myocardial infaction(AMI) model was bulit by ligation of Left anterior descending coronary in ovariectomized Sprague-Dauley rats..Then,they were treated with different doses of estradiol Benzoate. CD34+ cells in myocardium at 24h later after AMI were detected by Immunohistochemistry , CD34+ cells in peripheral blood were measured by flow cytometry on 1,3,7days after AMI, the expression of stromal cell-derived factor-1(SDF-1) in myocardium on 1,3,7 days after AMI and microvascular density in myocardium at 28 days after AMI was evaluated by Immunohistochemistry. Result CD34+ cells in peripheral bloood and myocardium ,the expression of SDF-1 and microvascular density at 4 weeks later after AMI in ovariectomized rats were obviously lower than in ovary intact rats.However,after indication with different doses of estrogen,. CD34+ cells in peripheral bloood and myocardium ,the expression of SDF-1 and microvascular density all were increased in ovariectomized rats with AMI,this effect was strongest especially in estrogen replacement therapy group Conclusion Replacement with estradiol in ovariectomized rats with AMI can improve the mobilization and homing of bone marrow stem cells into myocardium and increases angiogenesis after AMI,this effect could be mediated by promotion of expression of SDF-1 in myocardium.
Keywords：myocardial angiogenesis，bone marrow stem cells，mobilization;homing，estrogen
作者简介：金鑫（1983－），女，硕士研究生在读，研究方向：冠心病基础与临床。