雌激素对心肌梗死大鼠外周血干细胞及血管生成的影响

雌激素对心肌梗死大鼠外周血干细胞及血管生成的

影响1

金鑫，陈玉成△，曾智，刘伟强，王斌，王浩宇

四川大学华西医院心内科，成都（610041)

E-mail：chenyucheng2003@

摘要：目的探讨雌激素对急性心肌梗死大鼠外周血干细胞和心肌血管生成的影响。方法结扎去卵巢Sprague-Dauley(SD)大鼠左冠状动脉制作急性心肌梗死模型，给予不同剂量苯甲酸雌二醇干预治疗，分别于急性心梗24h后免疫组化法检测归巢心肌的CD34+细胞数量，于1、3、7d流式细胞术测定外周血CD34+细胞数，同时于心梗后1、3、7d免疫组化法测定心肌中基质细胞衍生因子（SDF-1）的表达，分析心梗4W后心肌组织中微血管密度判断血管新生情况。结果与卵巢完整大鼠相比，去卵巢大鼠心梗后外周血和心肌组织中CD34+细胞数、SDF-1的表达和4W后毛细血管密度显著降低，雌激素干预各组上述指标明显升高，其中，雌激素替代组最高。结论去卵巢大鼠心肌梗死前应用雌激素替代治疗，可增加心梗后骨髓干细胞的动员和归巢, 促进心肌毛细血管生成，这一作用可能于雌激素促进心肌SDF-1表达有关。

关键词：心肌血管生成，骨髓干细胞，动员，归巢，雌激素

大量的基础和临床实验均已证实，雌激素具有强大的心血管保护作用，如降低血清脂蛋白[1]，调节凝血纤溶系统[2]，增加内皮一氧化氮和一氧化氮合酶的合成[3]，提高组织的抗氧化能力[4]等。同时也有报道[5]，雌激素对受损心肌细胞和血管内皮细胞具有强大的修复作用，并促进心肌梗死后心功能的改善，间接调节导致心力衰竭和心室重构的内分泌因素如肾素－血管紧张素－醛固酮系统、心钠素、内皮素、前列腺素、基质金属蛋白酶等的表达，改善预后。最近，Iwakura等人[6,7]先后报道雌激素在动脉损伤后促进骨髓干细胞动员，使损伤血管再内皮化。但是，对于心肌梗塞发生后，雌激素对于外周血干细胞是否也有动员作用以及其机制目前尚无相应研究。我们推测，雌激素可能对骨髓干细胞的动员与归巢发挥作用并参与了心梗后心肌血管生成，这样的作用可能同雌激素改善心梗的预后有关。本研究通过观察不同雌激素水平下急性心肌梗死大鼠外周血CD34+细胞的动员和心肌归巢，探讨这一作用对心梗后血管生成的意义，并进一步探讨这一作用机制，为进一步认识雌激素在心血管系统中的药理作用提供一定的实验依据。

1. 材料和方法

1. 1 实验动物和材料

正常成年雌性Sprague-Dauley(SD)大鼠50只（四川大学华西动物实验中心），体重约180±20g；兔抗大鼠CD34+多克隆抗体、兔抗大鼠SDF-1多克隆抗体、Ⅷ因子相关抗原抗体和SABC试剂盒（武汉博士德公司）；流式细胞仪（美国Coulter公司，epics Elite ESP）。

1. 2 实验方法

1.2.1 实验分组

取雌性大鼠50只，随机分为5组，每组各10只。急性心肌梗死组（acute myocardial infarction，AMI）；去卵巢后急性心肌梗死组（ovariectomized myocardial infarction，OMI）：

1本课题受教育部博士点基金“心肌内注射雌激素血管生成效应及相关机制研究”（20040610057）资助

去卵巢后两周实施左冠状动脉结扎术；去卵巢后心梗＋雌激素治疗生理剂量组（estrogen physiological dose therapy，EPT）：去卵巢后两周实施左冠状动脉结扎术，给予苯甲酸雌二醇注射液0.1mg/kg肌注，隔天一次；去卵巢后心梗＋雌激素治疗大剂量组（estrogen high dose therapy，EHT）：去卵巢后两周实施左冠状动脉结扎术，给予苯甲酸雌二醇注射液1mg/kg 肌注，隔天一次；去卵巢后雌激素替代＋心梗组（estrogen replacement therapy，ERT）：去卵巢后给予苯甲酸雌二醇注射液1mg/kg肌注，隔天一次，两周后实施冠状动脉结扎术。

1.2.2 动物模型的建立

去卵巢术：用质量分数10％水合氯醛（3ml/kg体重）腹腔麻醉，消毒皮肤做下腹部正中切口，结扎切除双侧卵巢后逐层缝合。心肌梗死模型建立：将大鼠用质量分数10％水合氯醛（3ml/kg体重）作腹腔麻醉,气管插管,人工通气，四肢皮下置针型电极,记录心电变化。在心脏搏动最明显处分层开胸,用“0/6”缝线在左心耳根部下2mm处结扎左前降支,形成急性心肌梗死模型。剔除心电记录无ST 段弓背往上抬高和(或) 异常Q 波的大鼠，术后连续肌注青霉素3d，预防感染，继续喂养至术后四周。

1.2.3 外周血CD34+细胞的检测

分别于心梗后第1、3、7天经眼底静脉丛采血0.1ml，肝素抗凝，取50µL全血加入5µL CD34+多克隆抗体，充分混匀后静置30min，加入溶血剂充分裂解红细胞，4℃PBS洗涤两次，加入FITC标记的羊抗兔IgG，并设阴性对照，流式细

胞仪检测外周血中CD34+细胞占单个核细胞的百分率。

1.2.4 心肌组织中CD34+、SDF-1的表达检测

取心脏4％多聚甲醛固定24小时，常规石蜡包埋及梗死部位组织切片，片厚4µm。石蜡切片进行免疫组织化学染色，分别加CD34+(1:50)、SDF-1(1:100)抗体4℃冰箱中过夜，二抗(1：200,北京中杉公司)室温孵育1h，DAB显色后脱水透明,中性树胶封片。阴性对照片不加一抗，以正常羊血清替代，余步骤相同。日本Olympus显微镜下观察并照像。

1.2.5 心肌毛细血管密度测定

于心梗后4周处死各组大鼠，取出心脏4％多聚甲醛固定24小时，常规石蜡包埋及梗死部位组织切片，行Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色。口径小于25µm的血管被判定为毛细血管，与邻近的微血管、炎性组织或心肌细胞明显区分的任何棕染的内皮细胞或内皮细胞丛都被判定为一个可计算的微血管。可见的血管腔并不是计数微血管必需的结构。用日本Olympus公司光学显微镜计数每400倍视野中微血管的数目，以6个高倍视野微血管数的均数计数。

1. 3 结果判定及统计学分析

免疫组化结果判定采用双盲法。每例动物随机选取5张切片,对每一切片随机选取8个高倍视野记数，取其平均值作为测定值。统计学处理采用SPSS11.5分析系统，定量资料两组间比较采用t检验，多组均数比较使用单向方差分析（One-Way ANOV A）。P<0.05为差异有显著意义。