利用重组酵母菌生产人胰岛素

利用重组酵母菌生产人胰岛素

摘要利用套叠PCR技术合成重组人胰岛素基因，并在A链和B链之间加入Kex2酶切位点。将合成的重组人胰岛素基因以正确的阅读框插入到组成型分泌表达载体pGAPZα-A的α-factor信号肽序列的下游，构建成pGAPZα-A/Insulin重组分泌表达载体。表达载体用Bln I线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构建成分泌型表达Insulin的工程菌。SDS2PAGE和Native2PAGE的分析表明：蛋白在分泌表达过程中，加入Insulin的A链（2.4k）和B链（3.4k）之间的Kex2酶切位点发挥了作用，Kex2蛋白酶将A链和B链切开，在α-factor信号肽的作用下通过分泌途径将A链和B链分泌到胞外，同时A链和B链又以二硫键形成了高级结构。WesternBlot结果表明：重组蛋白能够与鼠抗人Insulin抗体发生特异性反应，具有与天然Insulin相同的免疫原性。通过单因素分析和正交实验法对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵培养基进行了筛选和优化；对高效表达人生长激素的培养条件进行了优化；根据优化的摇瓶发酵结果进行了补料分批发酵；对表达产物进行了初步鉴定。

关键词：重组人胰岛素，毕赤酵母，分泌表达，培养基优化，晶体收集

Abstract：Use nested PCR synthesis of recombinant human insulin gene, join Kex2 cleavage sites between the A and B chains. The synthetic recombinant human insulin gene in the correct reading frame was inserted into the constitu tive secretory expression vector pGAPZα-A α-factor signal peptide sequence Preparation the construct pGAPZα-A/Insulin recombinant secretory expression vector. The expression vector linearization Bln I treated electroporation competent cells of Pichia pastoris GS115 constructed expression of secretory Insulin engineered bacteria.The analysis SDS2PAGE and Native2PAGE showed that: the protein in the process of secretion expression added Insulin A chain (2.4k) and Kex2 cleavage sites between the B-chain (3.4k) played a role, Kex2 protease of the A and B chains cut through the secretory pathway in the role of the α-factor signal peptide of the a and B chains secreted into the extracellular domain, while the a-chain and B-chain disulfide bond formation Youyi advanced structure. WesternBlot: The results show that the recombinant protein was able to specifically react with mouse anti-human Insulin Antibodies having the same natural Insulin immunogenicity. By single factor analysis and orthogonal experiment method of high density fermentation of Pichia pastoris medium screening and optimization; optimized culture conditions of the high-level expression of human growth hormone; according flask fermentation optimization results the fed-batch fermentation; preliminary identification of the expression product.

Keywords: recombinant human insulin, Pichia pastoris, secretion of expression, media optimization, crystal collection

胰岛素是治疗糖尿病的常用特效药物，有很大的市场需求，以往主要是从猪、牛胰脏中提取，近年来重组人胰岛素已占领了市场的大部分份额。人胰岛素是首先在微生物中表达的蛋白之一。从1977年以后，在大肠杆菌和酵母中表达的重组人胰岛素在治疗中就取代了动物胰岛素。在大肠杆菌中表达的人胰岛素表现为单链或胰岛素原，它通常形成包涵体，在发酵后会变性和重折叠。在酵母中，能表达胰岛素单体或是二聚体，通过二硫键的正确配对形成正确折叠的产物，后经过酶切转化成人胰岛素。巴斯德毕赤酵母以其独特的生物学和遗传学特征成为当

今一种诱人的的外源基因表达系统，本文对人胰岛素的性质、巴斯德毕赤酵母基因表达系统的特点、菌体的大规模培养、研究进展及其对胰岛素基因的表达作一简要综述。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌种pGAPZα-A表达载体、E.coli Topl0F′、E.coli DH5α、P.pastoris GSll5均为Invitrogen公司产品，pMD18-T EasyVector购自Takara公司。

1.1.2生化试剂抗生素zeocin为Invitrogen公司产品，TaqDNA聚合酶、10×Taq buffer、限制性内切酶（Bln I、Xho I和Xba I）以及T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司。DNA回收试剂盒、DNAMarker购自Tiangen。蛋白质分子质量标准购自Solarbio公司。一抗rat anti-human Insulin购自北京赛驰生物科技有限公司，二抗goat anti-rat IgG-HRP购自Tiangen公司。其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3培养基细菌培养基为LB培养基，酵母平板培养基为YPD培养基，酵母种子培养基为BMGY培养基，酵母分批发酵培养基，酵母补料生长培养基，酵母诱导培养基，酵母鉴定培养基。固体培养基为在液体培养基中加入1.5%的琼脂粉。121℃高温灭菌20min。考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95％乙醇中，加入100mL 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤，最终试剂中含0.01％（w／v）考马斯亮蓝G-250，4.7％（w／v）乙醇，8.5％（w／v）磷酸。标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白用0.15mol／L NaCl配成lmg／mL 蛋白溶液。

1.1.4器材

分析天平、高压灭菌锅、恒温震荡培养箱、12.8L搅拌发酵罐、分光光度计、精密pH仪、高速冷冻离心机、生化培养箱、超级工作台、电泳仪、尾气分析仪、紫外检测仪、凝胶成像系统、F l e x S t a n d 中空纤维中试切向流系统、Q u i x S t a n d 中空纤维切向流系统

1.2方法

1.2.1Insulin基因片段的合成及连接

1.2.1.1基因片段及引物设计与合成根据In2sulin氨基酸序列，选用毕赤酵母偏爱密码子，分3段合成Insulin基因：

（1）Insulin基因片段1（Ins1）：5′-tttgtgaaccagcatttgtg tggttctcat ctggtggaag ctttgtac ct cgtgtgtggt gag-3′;

（2）Insulin基因片段2（Ins2）：5′-ttgctccacgatacc tcttt ggtcttagg agtgtagaaa aaccctct ct caccacacac gag-3′;Kex2

（3）Insulin基因片段3（Ins3）：5′-gttacagtag ttttccagtt ggtagagaga acagatagag gtgcaacatt gctccacgat acc-3′;

（4）引物1（P1）：5′-ta ctcgagaaaaga tttgtgaaccagcat ttgt-3′；

XhoI Kex2

（5）引物2（P2）：5′-gaggtgcaac attgctccac gatacc-3′；

（6）引物3（P3）：5′-gc tctagact attagttacagtagttttcc agt-3′；

XbaI

Ins1片段斜体划线部分与Ins2片段斜体划线部分互补，引物P1和P3分别引入Xho I和Xba I酶切位点，在P1和Ins2中各引入1个Kex2蛋白酶切位点。基因片段及引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.1.2套叠PCR连接Ins1和Ins2基因片段利用Ins1和Ins2部分互补及引物P1、P2进行PCR反应，PCR采用25μl反应体系，10×Taqbuffer（含200mmol/L Tris-HCl pH8.4；200mmol/L