解读饲用植酸酶测定的国标方法

解读GB/T 18634-2002

《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》

武汉新华扬生物有限公司詹连生

摘要：国标GB/T18634-2002《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》实施四年多来，为国内植酸酶工业的发展作出了重大贡献，但在实施过程中又受到了国内不少人士和企业的质疑，本文拟从实验室试验结果来探讨其科学性和严谨性，以期使更多的人士和企业能对国标有更进一步的全面认识。

关键词：国标植酸酶定义 pH值科学性严谨性

国标“GB/T 18634-2002《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》”（以下简称“国标”）是我国第一部关于植酸酶的国家推荐标准，实施四年多来，该标准为我国植酸酶工业的发展作出了重大贡献！但由于该标准的制订是基于早期的巴斯夫（BASF）植酸酶活性测定标准及产品特性基础上，而我国植酸酶工业在此阶段却在迅速的发展，通过植酸酶菌种的优选和基因化工程，使植酸酶产品的特性朝着越来越利于动物营养方向优化，致使现行国标在科学性、严谨性和适用性上出现了明显的缺憾，无法体现植酸酶的特性优势，从而在某种程度上又阻碍了我国植酸酶工业的发展！故找来最新版本的《BASF植酸酶活性测定（KC9505第三修订版）》，结合“武汉新华扬生物有限公司Q/XHY0020-2005《饲用植酸酶》”，对现行国标进行认真地解读，并以实验室真实数据来一一验证。

一、首先，对植酸酶活性单位定义科学性的理解，定义中有三个条件：植酸钠的浓度、反应温度和pH 值。

1、植酸钠的浓度

植酸酶活性测定的原理是，植酸酶在一定温度和pH条件下，在一定浓度的植酸钠盐溶液中能够从肌醇六磷酸中释放出无机磷；加入钒钼酸铵反应液可以终止反应，并与释放出来的无机磷反应生成黄色的钒钼酸磷复合物。用分光光度计在415nm波长处检测复合物的浓度，即可计算出样品中的相应酶活。

在试验中，我们注意到，只要所加入的植酸钠的量能足够保证反应所需即对实验结果毫无影响。也就是说：植酸钠在一定浓度范围内波动，对植酸酶活性的检测没有影响！

2、反应温度

一般来说，酶在动物体内的活动环境温度均在37℃左右，因此，结合动物体内最适宜酶激活温度，将植酸酶酶活的表现温度定为37℃是合适的。但是，植酸酶在不同温度条件下，其活跃程度也有所差异！见图1【注意：此温度曲线并不代表实际植酸酶的耐温性能，这是两种概念！】

所以，在植酸酶活性检测中，温度对植酸酶的酶活有较大的影响！因此，除反应前进行足够保温外，必须严格将反应温度控制在37℃，并且是反应试管内的溶液温度。

3、pH值

(1) 植酸酶包括两种组分，第一种组分PhytA和Pa的最适pH在2.5左右，主要在胃中起分解植酸的作用，动物胃中的pH也在2.5左右；第二种组分PhytB和Pb的最适pH在5左右，主要在肠道中起分解植酸的作用，动物肠道中的pH也在5左右。

(2) 微生物种类不同所产生的植酸酶系也不一样，有的只含有PhytA，有的只含有PhytB，有的含有PhytA 和Pb，有的同时含有四种酶活。粗酶中含PhytA、PhytB、Pa和Pb，其最适pH分别为3.2、5、2.8、5，它们都比较耐酸，对低pH不敏感；因此，不同的酶抽提最适pH不同，PhytA和Pa抽提最佳pH在3左右，在此范围内比较稳定，PhytB和Pb抽提最佳pH在5左右。

(3) 商品植酸酶在动物体内发挥作用的主要部位有：猪的胃、家畜的嗉囊和胃，虽然在小肠、甚至大肠中也有，但由于部位靠后，对提高磷的利用来说意义不大；而猪胃内的pH为2～3，糜食后pH为4左右，鸡嗉囊的pH为4.5～5.0，猪和鸡小肠中的pH＞6.0。

我们测试了华扬赛乐植酸酶在37℃条件下，pH值对其活性的影响，同时与天然植酸酶等其它植酸酶（资料数据来自《植酸酶实用指南》，张若寒著）做了对比（见图2）：

由此可见：

天然植酸酶只能在很窄的酸碱度范围内有活性，活性最高峰值在pH5.5，而且，pH值稍有变动，植酸酶活性即会急剧降低，所以，天然植酸酶在动物体内水解植酸的效率会很低；G植酸酶在位于pH2.5～pH5.0间有一较大活性区间,其活性最高峰在pH4.0左右,但一旦到了pH5.5以后,其活性大大降低；B植酸酶在位于pH4.5～pH6.0间有一高活性区间，其最高峰在pH5.5附近，在位于pH2.5～pH4.5间有一次高活性区间，能活动在pH2.0～pH6.5的较宽范围内，但在到了pH2.5 ～pH6区间之外，活性则出现大幅降低；华扬赛乐植酸酶在位于pH2.5～pH5.0间有一高活性区间，最高峰值在pH4.0左右，在pH4.5～pH6.5间有一个次活性高峰，能活动在pH2.5～pH6.0的较宽范围内。

所以：植酸酶在动物体内发挥活性的最适pH应在2.0～5.0，从这点意义上来讲，商品植酸酶的活性峰值也应在pH2.0～pH5.0，才能保证其在动物饲养中使用的有效性。不同商品植酸酶，因其微生物菌种来源不一、生产工艺也有所差异、所用载体的不同以及其它为我们还未知的因素，等等，从而直接导致其酶活活性峰值区间及最高峰出现的时机也有所不一样。

综上所述，我们认为，植酸酶的酶活定义应改为：样品在植酸钠浓度为5.0 mmol／L、温度37℃、PH 值在2.0～5.5区间的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

二、其次，对国标实施过程中的实验严谨性的验证。

1、缓冲溶液配制中，表面活性剂吐温－20的添加对植酸酶酶活的影响。

吐温－20是一种表面活性剂,能起到增溶、增稳的作用,但同时吐温－20的加入也使可溶性的磷钼黄产生沉淀，使有色溶液褪色,使测定方法的机理受到影响；同时，因吐温－20是一种化工产品，其内在品质会直接影响其使用效果，使检测结果受到较大影响。

在试验中，我们注意到：吐温－20的加入量对植酸酶酶活的检测结果有很大的影响！正因为如此，BASF 在不断修改自己的企业标准时，将原先加入0.1g/1000mL吐温－20的较准确数量，改为三滴吐温－20的不准确含糊数量，实际上是在淡化吐温－20，因为三滴吐温－20的含糊数量可以是0.05g/1000mL左右，也可以是0.14g/1000mL左右或更多，所以，在实际操作中，我们常常将0.1 g/1000mL吐温－20的量控制在0.08g/1000mL左右！

同时，我们在检测中发现：样品经加有吐温－20的缓冲液提取后的样液在反应后，一方面，不管是标准溶液，还是样品溶液，包括空白溶液，在0.1Abs左右的低吸光度的情况下，溶液离心后始终得不到清澈的上清液，也就是说，始终得不到溶液的真实吸光度，那么，最终的计算结果也就可想而知了！另一方面，反应溶液经离心后需要尽快比色分析，这就是为什么用国标检测植酸酶活性时，检测结果有很大波动的原因之一。

此外，我们也发现，用加有吐温－20的缓冲溶液提取不同厂家的植酸酶，其酶活检测结果有很大波动，这也许同这些植酸酶含有不同比例的PhytA、PhytB、Pa和Pb有关！当然，这还有待进一步探讨。

所以，在实际检测过程中，我们更倾向于用与动物体相关的活性剂，以便能更直接和更真实地表现出植酸酶在动物体内的表现。

在实验过程中我们使用另一种表面活性剂：0.5g/1000mL的BSA(牛血清白蛋白)替代0.1g/1000mL吐温20起到了很好的效果，运用加BSA的缓冲溶液作植酸酶的检测，对国内外各厂家生产的植酸酶都有较高的检出率，而且非常易于操作，检测结果重复性好，能更广泛地适用于各类不同来源植酸酶的检测，同时也很好地模拟了动物体内的酶的作用环境，更能真实体现植酸酶在动物体内的实实在在的效果！

因此，我们建议：

(1) 乙酸缓冲液的配制中用BSA替代吐温－20作为表面活性剂；

(2) 即使是使用吐温－20，其使用量也应控制在0.08g/1000mL。

2、在使用国标缓冲溶液（II）配制标准溶液时，所作出的标准曲线更本不成线型关系的，不符合比色原理！这过中之祸就是在配制缓冲溶液（II）时，使用了高达5g/1000mL的吐温-20！

3、植酸钠溶液的配制中，调节pH对植酸酶酶活的影响。

植酸钠用蒸馏水配制后，其pH约为11左右，分别用pH5.5和pH5.0的缓冲溶液配制后，其pH值分别为6.2和5.9左右，与pH5.5有较大的差别，这意味着，植酸酶最终反应时的pH值不可能是国标规定的