光敏剂的结构与性质

生命科学与工程学院
实验报告
目录
0前言
理想光敏剂的结构特征和光敏性质
1抗菌光敏剂的分类及应用
2实验部分
2.1实验一
2.2实验二
3展望
0前言
光动力疗法( photodynamic therapy，PDT) 是利用光敏剂( photosensitizer，PS) 在异常组织选择性聚集，在分子氧的参与下，由特定波长的光激发产生活性氧( reactive oxygen species，ＲOS) ，并发生一系列光化学反应，对异常组织进行选择性杀伤的一种疾病诊疗新技术。

由于抗生素的滥用，耐药微生物菌株数目正以惊人的速度增加，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ( methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MＲSA) ，耐万古霉素粪肠球菌( vancomycin-resistant enterococci，VＲE) ，耐多药分枝杆菌和真菌等［1］。

因此，探索新的抗微生物治疗方法迫在眉睫。

光动力抗菌化学疗法( photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT) 作用机制与 PDT 相似，可用于灭活微生物，并已成为当前微生物耐药情况下一种可选择的抗病原微生物新方法。

光动力抗菌化学疗法机制尚不明确。

目前认为光敏剂的光动力杀伤作用主要包括 I 型和Ⅱ型两种机制: I 型机制是指光敏剂的三重态氧与底物发生电子转移，产生自由基或自由基离子，进而对细菌产生氧化损伤和杀灭作用。

Ⅱ型机制是指光敏剂的三重态氧与基态分子氧发生能量传递产生单重态氧，这些单重态氧与邻近生物分子发生反应以造成损伤。

一般认为 PACT 作用于微生物是多靶点，
但主要是破坏细胞的外部结构，从而破坏细胞的新陈代谢。

PS 不像传统抗生素需要到达微生物细胞特定部位、与相应的结构粘附、结合及发生化学反应，因此，微生物通过阻断或减少吸收、增加代谢及药物排泄而产生抵抗的概率很低［2，3］。

理想 PS 属性包括: ( 1) 化学组分单一、结构明确且性质稳定; ( 2) 在光照时具有强的光毒性，对机体无副作用，安全; ( 3) 可以快速从皮肤和黏膜清除; ( 4) 单态氧及其它活性氧物质产量高; ( 5) 较长波长的光激发; ( 6) 合成工艺简单、价格低廉; ( 7) 水中、注射液中和血液替代品中具有高溶解性。

理想光敏剂的结构特征和光敏性质
单线态氧在细胞质中的扩散范围局限于45nm 之内，所以光线的组织穿透深度对光动力治疗是非常重要的因素，组织的增加和吸收波长的减少都将影响光的吸收和分散。

组织吸收成分包括核酸、氨基酸、血红蛋白和黑色素等，对于核酸和氨基酸，它们的吸收波长通常在 250 ～ 300nm 之间，所以它们对于波长大于 600nm 的光的吸收作用很小。

大多数组织的吸收本质是由血红蛋白控制的，而血红蛋白的最强吸收峰出现在波长小于620nm 处［2］。

随着波长从620nm 增加至 800nm，这些吸收峰的增长很弱。

其他的内源性发色基是黑色素，它是由酪氨酸分子凝结而成的聚合物，并在 400 ～ 700nm 区间均有吸收，但对较长波长的吸收相对减少。

以上所有因素提供一个事实，小于 550nm 波长的光穿透力很低，而在 550 ～630nm 穿透力则成倍增长，当达到 700 ～800nm 后，对组织的穿透能力大幅度提升。

然而，波长大于 800nm 的结果却不能令人满意。

如果吸收波长太长( 大于 800nm) 则难于满足形成1O2 的能量要求，意味着光子没有足够的能量使处于三线态的光敏剂将基态氧分子激发到单线态。

而且，当波长增加时，化合物对光的稳定性通常也会减弱。

因此，理想的光敏剂应该在 660 ～800nm 之间( 即“治疗窗口”) 有强吸收。

由于 660 ～800nm 的光提供了最佳的组织穿透强度以及充分的能量来形成单线态氧，发展具有这一范围波长吸收的光敏剂是光动力疗法中的研究重点。

波长较长的光可增加穿透深度，这是发展具有这种吸收波长光敏剂的主要
原因，萘酞菁( 776nm) 和细菌叶绿素( 780nm) 的最大吸收波长都在治疗窗口内。

然而，光敏剂本身的光吸收可以限制组织光穿透，这种现象被称为光敏剂
的“自屏蔽”。

如果光敏剂对治疗波长的光具有非常强烈的吸收则其自屏蔽现象
尤其明显。

许多光敏剂在暴露于光时容易发生称之为光漂白的光破坏过程，而不同化学结构的光敏剂具有变化多端的光漂白率。

所以，PDT 中应用的光敏剂应该足够稳定以避免诸如光漂白的降解过程［3］。

优秀的光敏剂分子应该具有良好的水脂溶性; 具有两亲性的药物分子有利于药物透过细胞膜。

光毒性高而暗毒性低的光敏剂也是保证正常组织免受损伤的一个方面，可提高 PDT 治疗的选择性。

PDT 之所以优于其他肿瘤治疗方法，一个重要原因就在于所用光敏药物在无光照时具有低水平的暗毒性，而在对靶组织进行选择性光照时，靶组织内的光敏剂被激活而选择性地作用于靶组织。

PDT 光敏剂在患者体内的药代动力学消除应该迅速，以缩短治疗后避光保护的时间和避免长时间的皮肤光敏性。

它们应该对红外或远红外区的光具有强烈吸收，以使 PDT 的治疗作用可以到达尽可能深的部位，而且所使用的光不会导致正常组织光敏化。

1抗菌光敏剂的分类及应用
1.1卟啉类化合物
卟啉类化合物具有相对较高的活性氧产量，是常用的 PS 之一，但它持续 4-6 周左右的暗毒性作用限制了它的广泛应用。

因此，近年来研究者们一直致力于开发更理想的卟啉类PS。

5-氨基酮戊酸 ( ALA) 作为一个典型的卟啉类 PS，本身不具备光化学反应特性，但可生物合成原卟啉 IX( PpIX) 的前体。

PpIX 能迅速从身体清除，所以暗毒性作用时间减少。

研究发现 ALA 介导 PACT 具有广谱的抗微生物效应［4］，因此 ALA 介导的 PACT 广泛应用于皮肤病治疗，如细菌、真菌及病毒感染等。

但所有有核细胞都能够利用 ALA 合成 PpIX，因而与其他PS 相比，它的选择性低; 另ALA 介导PACT 光照时疼痛感强烈。

其他光敏剂，像带阳离子卟啉化合物可以作为广谱抗菌 PS，对耐甲氧西林金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌具有良好的杀伤效果。

光敏素 ( photofrin) 介导 PACT 能杀灭 MＲSA 感染关节炎小鼠模型的 MＲSA［5］。

Photogem 介导的 PACT 能杀灭热带念珠菌和都林柏菌［6］。

除了这两种真菌以外，有报道称 Photogem 介导的 PACT 还能完全杀灭口腔中白念珠菌、克鲁斯氏念珠菌和光滑念珠菌［7］。

1.2细菌叶绿素衍生物
细菌叶绿素衍生物激发光波长为 700 ～900 nm，可以作为PDT 和 PACT 的光敏剂。

细菌叶绿素衍生物介导 PACT 对真菌、革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有一定效果，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌［8］。

1.3酞菁及衍生物
酞菁及其衍生物的激发波长为 670 ～ 780 nm。

金属离子修饰酞菁类化合物后具有活性氧产率高、持续时间长等特点，它介导的 PACT 对金黄色葡萄球菌有杀灭作用，且未发现金黄色葡萄球菌对 PACT 抵抗［9］。

金属离子修饰酞菁类化合物介导 PACT 也能有效处理局部感染 MＲSA 小鼠模型的 MＲSA［10］。

还有研究指出锌修饰酞菁类后介导的 PACT 能够有效杀灭革兰氏阴性大肠杆菌。

1.4天然光敏剂及衍生物天然光敏剂及其衍生物具有高效低毒的特
点，因此备受青睐。

目前主要有 4 大类: 姜黄素类、核黄素类，醌类化合物和补骨脂素类。

1．4．1 姜黄素类
姜黄素具有广泛的药理、毒理作用，在医学多个领域均有应用，包括抗癌、抗炎和抗感染。

姜黄素介导 PACT 副作用小，抗菌效果良好，因此临床应用潜力强。

它被455 nm LED 激发且能在30 min 内杀灭念珠菌［11］; 在蓝色LED( λ = 420 ± 20 nm) 设备照射 4 min 后可以杀灭变形链球菌［12］。

在体外实验中姜黄素介导 PACT 能够杀死龋齿中的细菌［13］。

1．4．2 核黄素
核黄素有两个光吸收峰，分别在紫外光区 360 nm 和蓝光区 440 nm。

当核黄素被蓝光激发时能杀死金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌［14］，主要应用于浅表感染治疗。

1．4．3 醌类化合物
醌类光敏剂是带有扩展π-电子系统的化合物，在光和氧的作用下呈现细胞毒性。

醌类化合物具有良好的光敏性质，可被红外光激发( 激发波长为 540 ～610 nm) ，单线氧产率高。

金丝桃素( hypercin) 是中性的疏水性化合物，一直作为一种抗癌 PS 进行研究较多。

金丝桃素经修饰增加其水溶性也可介导 PACT 杀灭革兰氏阳性金黄色葡萄球菌，但对革兰氏阴性大肠杆菌无明显作用［15］。

另
外，醌类化合物中的竹红菌素( hypocrellin) 和竹红菌素 B( hypocrellin B) 作为 PS 其抗癌效果比抗菌效果好。

尾孢菌素( cercosporin) 尽管活性氧产率高，但是抗微生物作用弱。

1.4.4 补骨脂素
补骨脂素类光学毒性机制主要包括两个方面:
①核酸中鸟嘌呤核苷的羟基化，此反应通常以单线氧为中介;
②与病毒的核酸形成复合物，从而使病毒失活。

补骨脂素类介导的 PACT 对病毒都有一定灭活作用［16］。

1.5亚甲蓝和吩噻嗪类化合物
亚甲蓝( MB) 已经在临床上作为光敏剂( λmax = 660 nm) 使用。

MB 介导PACT 能杀灭口腔念珠菌病; 且 MB 介导 PACT 能增加念珠菌细胞膜的渗透性，进而增加其对抗生素的敏感性。

MB 介导PACT 还可杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，且副反应轻［17］。

甲苯胺蓝( TBO) 介导 PACT 对葡萄球菌有明显的杀伤作用［18］。

在体内研究中，TBO 介导 PACT 可明显杀灭创伤动物模型的创伤弧菌［19］。

新亚甲基蓝( NMB) 介导 PACT 治疗念珠菌感染小鼠以及多重耐药鲍曼不动杆菌感染的烧伤小鼠，结果显示均有一定治疗效果［20，21］。

1.6其他合成染料光敏剂
四碘荧光素是一种已经批准作为食品色素的碘化氧杂蒽染料。

四碘荧光素易与细菌生物膜结合，在口腔科使用较多。

四碘荧光素介导PACT 比光敏素( photofrin) 、亚甲蓝( MB) 对变异链球菌更有效。

四碘荧光素介导 PACT 处理口腔念珠菌感染可以显著减少粘附在上皮细胞的酵母菌和念珠菌，并且不损害正常组织［22］。

吲哚菁绿( ICG) 主要用作造影剂。

ICG 也可作为抗菌 PS，它能被 810 nm 二极管激光激发，它介导 PACT 能杀灭野生型和耐药株金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌［23］。

方酸菁及其衍生物在体外具有良好光动力性质。

近年来，方酸菁及其衍生物PDT 抗肿瘤方面研究较多。

1.7新型纳米光敏剂
近些年来，纳米粒子广泛使用，由于它可提高光化学效率，因此PDT 可与纳米技术结合，达到更好的治疗效果。

纳米医学材料可以作为药物载体，优化药物输送，防止 PS 过早释放和失活，改善药物动力学，增加渗透率，提高药物在靶组织的浓度，减轻毒副反应，提高生物利用度［24］，且纳米粒子能偶联多种官能团，发挥多种功能，如显像剂，靶向治疗等。

1.7.1富勒烯
富勒烯是碳原子独特排列的球形结构，广泛应用于生物医学领域。

富勒烯超氧离子产率高，但因为吸收峰倾向于蓝绿光波长，它的穿透能力差，水溶性也差，因此在浅表感染如烧伤、创伤应用较多。

通过化学修饰富勒烯水溶性得到改善、生物相容性也有所加强，产生活性氧的能力得到提高，但是激发光波长和生物降解问题仍限制了其临床应用。

富勒烯衍生化合物介导 PACT，发现对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌甚至对真菌都有杀灭效果。

且富勒烯类化合物介导 PACT 对真菌更具有杀伤作用，这可能与细菌、真菌细胞壁差异有关［25］。

1.7.2碳纳米管
目前碳纳米管的基本分两类: 多壁型和单壁型。

碳纳米管具有高纵横比( 长度比直径) 和大表面积质量比，广泛应用于净化空气和水。

多壁型碳纳米管衍生
物具有强大的氧化作用，可用于消毒。

研究发现卟啉共价修饰多壁型碳纳米管被激发后显著降低甲型流感病毒感染哺乳动物细胞的能力［26］。

1.7.3石墨烯
石墨烯是碳原子杂化结构。

石墨烯衍生物具有良好的水溶性及生物相容性，可以封载大量疏水性药物。

石墨烯衍生物被绿色激光( 470 nm，1 W) 激发产生活性氧，可杀死耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌［27］。

1.7.4 脂质体
脂质体是一种球形纳米囊泡，疏水中心可以容纳疏水性药物或PS，而亲水性中心或核心可以容纳水溶性药物或 PS，是研究较广泛的胶体运载工具［28］。

脂
质体封装后，PS 的细胞吸收机制有两种:
1、与细胞膜融合后释放内容物到胞质;
2、吞噬细胞吞噬、代谢脂质体，从而将活性药物释放到细胞。

使用脂质体可以显著改善 PDT 和 PACT 的疗效和安全性。

有研究指出脂质体介导的PACT 可有效治疗深部感染。

脂质体可以包埋荧光剂使得 PACT 在缺乏传统光源条件下可以激活 PS，进一步促进 PACT 治疗深部感染的发展。

脂质体最大的缺陷是不仅可以被微生物吸收也可以被正常组织细胞吸收，阳离子脂质体更容易与带负电荷的哺乳动物宿主细胞的细胞膜融合。

1.7.5二氧化钛( TiO2) 化合物
二氧化钛半导体化合物毒性低，稳定。

纳米二氧化钛对感染鱼类细菌具有很强的杀菌作用，且能增强鱼类中性粒细胞对细菌的杀灭作用，因此，推荐水鱼农场在饲料中添加纳米二氧化钛，防止或减少鱼类细菌疾病的发生［29］。

二氧化钛纳米颗粒能被自然光或紫外线激发，当二氧化钛纳米颗粒被小于385 nm 的紫外线激发，可以高效产生活性氧，能杀死肿瘤细胞、细菌、真菌等。

二氧化钛化合物介导 PACT 也能杀灭芽孢杆菌孢子、炭疽杆菌毒素，甚至能灭活耐抗生素细菌: 像耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MＲSA) ，多重耐药鲍曼不动杆菌( MDＲAB) ，耐万古霉素大肠菌( VＲE) ，包括生物膜［30］。

经化学修饰后的二氧化钛具有更强的抗菌作用。

二氧化钛纳米粒子因其抗感染性强等优势正被研究应用于医学植入物表面［31］。

1.7.6金 Au 和银 Ag 纳米粒子
金( Au) 纳米粒子有良好的生物相容性，也可以像其他纳米材料一样作为药物运载输送工具，使其在生物体中广泛使用。

金纳米粒子已被证明对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，耐万古霉素的肠球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌及流感病毒均可达到良好杀伤效果。

银与生物分子中硫磷原子有较高的亲和力，因而银纳米粒子可以与细胞膜中含硫氨基酸反应导致细胞死亡。

低浓度状态下，比起金或锌纳米粒子，Ag 纳米颗粒对变异链球菌的杀灭效果更强［32］。

Ag 纳米颗粒还对 HIV、流感病毒、单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒和猴痘病毒、及真菌等都有一定杀伤能力。

另外，其他纳米材料，像高分子聚合物纳米粒子、二氧化硅硅纳米粒子、磁性纳米粒子、稀土纳米转换发光材料都有进行 PDT 的相关研究。

2实验部分
2.1实验一脱镁叶绿素的制备
2.1.1原理
对粗提取的叶绿素a反应制备脱镁叶绿素a；
2.1.2实验过程
称取200 g糊状叶绿素溶于600 mL乙醚，将该混合溶液加入到2000 mL圆底烧瓶内，0 ℃下搅拌20 min后，缓慢加入800 mL 36%浓盐酸。

在0-4 ℃条件下搅拌2.5 h 后,倒入分液漏斗中静置，得到下层酸液，加冰水1000 mL左右稀释,用NaOH调节pH至中性（pH值5-6），抽滤，干燥得滤饼粗产品黑色固体脱镁叶酸a。

粗产品，用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷－甲醇( 100∶0 ～100∶3) 洗脱，得到粗品，再用中压制备色谱纯化，得 4． 8 g 黑色固体脱镁叶绿酸 a，收率 2． 4% 。

2.1.3实验结果
从图1可以看出，左边的实验组部分与右边的标准组部分在约1.5cm 处具有相似的成分，即脱镁叶绿素，由此可以证明已经成功制取出脱镁叶绿素，次实验结果可用于实验二继续制备二氢卟吩e6。

2.2实验二、二氢卟吩e6的制备
2.2.1原理
2.2.2实验过程
20g 脱镁叶绿酸a 溶于100 mL 甲醇溶液中。

将此混合溶液逐滴加入到300 mL 25%（75g KOH ）氢氧化钾乙醇溶液中回流搅拌。

用2 mol/L 的稀盐酸调节pH 至5-6，抽滤、干燥得滤饼二氢卟吩e6粗品.
2.2.3实验结果
图1: 脱镁叶绿素实验组与标准组点板对照图。